炎癥小體在衰老腎臟中的表達(dá)變化研究.pdf

1、目的:腎臟衰老的機(jī)制目前尚不很清楚。近年研究顯示免疫炎癥反應(yīng)與腎臟衰老有關(guān)。在機(jī)體衰老過程中，適應(yīng)性免疫反應(yīng)(adaptive immunity response)顯著下降，表現(xiàn)為免疫衰老(immunosenescence);而固有免疫反應(yīng)(innate immunityresponse)明顯被激活，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一種低水平、慢性炎癥狀態(tài)，即炎性衰老(inflamm-aging)。腎臟作為代謝活躍器官，極其容易衰老。炎癥小體(inflam

2、masome)是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組分，由細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體(patternrecognition receptors，PRRs)、接頭蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like proteincontaining a CARD)及procaspase-1蛋白組裝而成的高分子量多蛋白復(fù)合物。多種不同外源性病原相關(guān)分子模式(pathgen-associated molecular pattrens，PA

3、MPs)如細(xì)菌，和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)如活性氧(reactive oxygen species，ROS)可通過與模式識(shí)別受體結(jié)合誘導(dǎo)炎癥小體的組裝與激活，導(dǎo)致模式識(shí)別受體蛋白（如NLRP1，NLRP3，NLRC4，AIM2）發(fā)生自身寡聚化，招募接頭蛋白(ASC)及效應(yīng)蛋白(caspase-1)前體，共同裝配成多蛋白復(fù)合體，激活caspase-1

4、（IL-1β轉(zhuǎn)化酶），進(jìn)而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18前體(proIL-1β和proIL-18)的剪切成熟和分泌，引起系列炎癥反應(yīng)。目前對(duì)于各種內(nèi)、外源性分子配體如何激活炎癥小體的機(jī)制還不清楚。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控各種促炎因子表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。配體分子與TLR4及IL-1R結(jié)合后可激活下游NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控炎癥小體組分NLRP1，NLRP3，NLRC4，AIM2及proIL-1β和proIL-18的表達(dá)機(jī)制，此過程

5、為炎癥小體的“priming”。目前僅有NLRP1，NLRP3，NLRC4，AIM2四種模式識(shí)別受體可通過組裝成炎癥小體在固有免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。
　　近年研究顯示炎癥小體與多種疾病如老年癡呆、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但是，目前對(duì)炎癥小體在腎臟器官衰老中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究中我們首次系統(tǒng)性地觀察了調(diào)控炎癥小體表達(dá)的上游“priming”信號(hào)通路分子，炎癥小體成分及其下游的促炎細(xì)胞細(xì)胞因子在腎臟衰老中

6、的表達(dá)變化。這些研究對(duì)于理解腎臟衰老發(fā)生和發(fā)展機(jī)制以及探索新的延緩衰老相關(guān)腎臟疾病的治療方案具有重要的意義。
　　方法:1、將雄性Fischer344大鼠隨機(jī)分為3月齡（青年組）和24月齡（老年組）兩組，每組各10只。留取24小時(shí)尿液標(biāo)本，抽取血樣標(biāo)本后處死。尿液標(biāo)本檢測(cè)尿蛋白/肌酐比率，血液標(biāo)本檢測(cè)生化指標(biāo)及腎功能指標(biāo)(Scr、BUN)。留取部分腎臟組織液氮凍存，分別用于western blot及RT-qPCR檢測(cè)。另外取部分腎

7、組織進(jìn)行OCT包埋和10％甲醛固定，分別用于免疫熒光染色、PAS染色及免疫組織化學(xué)染色。2、用PAS染色技術(shù)檢測(cè)青年組與老年組大鼠腎臟組織的病理變化。3、用western blot系統(tǒng)性地分析3月齡與24月齡腎臟組織中①調(diào)控炎癥小體表達(dá)的“priming”信號(hào)通路中的TLR4（Toll樣受體4）、IL-1R及其下游NF-κB信號(hào)通路分子Phospho-IRAK4，Phospho-IKKβ，Phospho-IκBα，Phospho-NF-

8、κBp65（Phospho-表示激活分子）的表達(dá)活化情況;②炎癥小體成分中NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、procaspase-1、caspase-1及下游促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的前體及活化形式的表達(dá)水平。4、用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)兩個(gè)年齡組腎組織中NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA的表達(dá)變化情況。5、用免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光雙染色技術(shù)進(jìn)一步明確衰老腎組織中NLRP3、NLRC4、

9、caspase-1的表達(dá)及在腎小球內(nèi)細(xì)胞定位情況。
　　結(jié)果:1、PAS染色結(jié)果顯示，3月齡大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，而24月齡大鼠腎組織中系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增寬，硬化腎小球數(shù)目增多，彌漫性腎小管萎縮，腎間質(zhì)纖維化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。2、western blot結(jié)果顯示，與3月齡大鼠腎組織相比較，24月齡大鼠腎臟中調(diào)控炎癥小體表達(dá)的“priming”信號(hào)通路分子TLR4，IL-1R及下游NF-κB信號(hào)通路分子Phospho-IRAK

10、4、Phospho-IKKβ、Phospho-IκBα、Phospho-NF-κBp65表達(dá)均顯著升高;炎癥小體成分NLRP3、NLRC4、pro-caspase-1、caspase-1及下游的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18及pro-IL-18均明顯激活;NLRP1、AIM2、pro-IL-1β隨增齡變化不顯著。3、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在大鼠腎臟組織中，NLRP3、IL-1β、IL-18的表達(dá)隨增齡顯著升高。4、免疫組織化學(xué)染色

11、結(jié)果顯示，與3月齡大鼠腎組織相比較，24月齡大鼠腎組織中NLRP3的表達(dá)顯著升高，并且主要分布于腎小球內(nèi)，腎小管內(nèi)基本無表達(dá)。免疫熒光雙染色結(jié)果顯示，衰老大鼠腎組織內(nèi)高表達(dá)的NLRC4及caspase-1主要分布在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎小管及腎間質(zhì)無表達(dá)。
　　結(jié)論:在腎臟衰老過程中參與調(diào)控炎癥小體表達(dá)的上游“priming”信號(hào)通路分子被明顯活化，NLRP3炎癥小體與NLRC4炎癥小體被顯著激活并導(dǎo)致下游促炎細(xì)胞因子IL-1