TRB3在游離脂護(hù)酸誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　在世界范圍內(nèi)，糖尿病已成為繼心腦血管疾病、癌癥之后危害人類健康的第三大非傳染性疾病，糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。近十年來，我國(guó)人口糖尿病發(fā)病率激增，到2010年，中國(guó)成年人糖尿病發(fā)病率已達(dá)11.6％。糖尿病引起的糖代謝紊亂導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生命和健康。因此，闡明糖尿病的發(fā)病機(jī)制以開發(fā)有效的防治方法成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　糖尿病患者中90％以上是以胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞衰

2、竭為特征的2型糖尿病。其中胰島β細(xì)胞凋亡導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)量減少是2型糖尿病發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，如何保護(hù)和防止胰島β細(xì)胞功能衰竭和細(xì)胞凋亡是目前2型糖尿病的防治的關(guān)鍵之一。β細(xì)胞凋亡的機(jī)制與脂毒性密切相關(guān)，2型糖尿病患者中約有80～90％屬于肥胖或超重，其體內(nèi)脂肪組織分解產(chǎn)生的游離脂肪酸（freefattyacids，F(xiàn)FA）顯著增加，大量FFA損害胰島β細(xì)胞功能，加速和促進(jìn)β細(xì)胞凋亡。脂毒性致使胰島β細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制還不是十分清

3、楚。針對(duì)這一過程相關(guān)分子的干預(yù)可能遏制或延緩β細(xì)胞的凋亡，從而有助于延緩2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。
　　Tribbles同源蛋白家族（TRBs）成員TRB3是一種應(yīng)激相關(guān)蛋白，通過與胰島素信號(hào)通路中的重要分子Akt結(jié)合，作為內(nèi)源性Akt抑制劑，阻斷其磷酸化并干擾Akt向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，影響Akt的功能，從而抑制胰島素信號(hào)細(xì)胞內(nèi)的傳遞途徑，導(dǎo)致外周組織胰島素抵抗。目前研究顯示TRB3在不同的細(xì)胞中細(xì)胞具有促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的作用，存在明

4、顯爭(zhēng)議。由于該分子不僅參與調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，而且介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，推測(cè)其可能與胰島β細(xì)胞的脂毒性相關(guān)。TRB3是否參與脂毒性情況下的胰島β細(xì)胞凋亡，國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究利用基因過表達(dá)和基因敲降技術(shù)，在體外細(xì)胞模型和體內(nèi)胰島β細(xì)胞移植瘤模型中首次證明了TRB3在脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡中的作用，并對(duì)其介導(dǎo)β細(xì)胞凋亡相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　研究目的
　　1.驗(yàn)證游離脂肪酸對(duì)胰島β細(xì)胞TRB3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并探討其

5、可能的分子機(jī)制;
　　2.研究TRB3與脂毒性導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并探討TRB3介導(dǎo)脂毒性所致的β細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　研究方法
　　第一部分游離脂肪酸對(duì)胰島β細(xì)胞TRB3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.C57BL/6小鼠連續(xù)7天腹腔注射高濃度游離脂肪酸(Palmitate，PA)，采集小鼠血清并檢測(cè)血清游離脂肪酸濃度，分離純化小鼠胰島，采用Caspase-Glo3/7蛋白酶活性試劑盒檢測(cè)

6、小鼠胰島凋亡情況。
　　2.應(yīng)用Real-timePCR和Westernblot檢測(cè)小鼠胰島TRB3及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP和ATF4mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　體外實(shí)驗(yàn)
　　1.構(gòu)建胰島β細(xì)胞脂性凋亡模型，應(yīng)用TUNEL染色法檢測(cè)游離脂肪酸對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響:為觀察不同濃度PA刺激對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響，我們分別給予0，0.2，0.4及0.8mM的PA孵育INS-1細(xì)胞24小時(shí);為觀察不同作用時(shí)間P

7、A刺激對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響，采用0.2mM的PA孵育INS-1細(xì)胞O，12，24，48小時(shí)。
　　2.應(yīng)用Real-timePCR和Westernblot檢測(cè)游離脂肪酸誘導(dǎo)的TRB3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP和ATF4的mRNA及蛋白表達(dá)水平的關(guān)系。
　　3.應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)敲降INS-1細(xì)胞的CHOP基因，應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)CHOP基因沉默對(duì)游離脂肪酸致INS-1細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用Westernblot檢

8、測(cè)敲降CHOP對(duì)INS-1細(xì)胞TRB3表達(dá)水平的影響。
　　第二部分TRB3參與調(diào)控游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　1.利用Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建可誘導(dǎo)性表達(dá)TRB3的胰島β細(xì)胞系，采用Real-timePCR、Westernblot和細(xì)胞免疫熒光染色驗(yàn)證所構(gòu)建的β細(xì)胞TRB3基因的可誘導(dǎo)性。
　　2.應(yīng)用Caspase-3活性檢測(cè)、TUNEL染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC/PI

9、雙染分析TRB3過表達(dá)對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡的影響，
　　3.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在INS-1細(xì)胞及TRB3細(xì)胞中敲降TRB3，并應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)TRB3基因沉默對(duì)游離脂肪酸致β細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.應(yīng)用Westernblot檢測(cè)TRB3過表達(dá)或敲降對(duì)AKT、PKCδ的磷酸化水平及PKCδ核轉(zhuǎn)位的影響，并采用TUNEL染色檢測(cè)PKCδ抑制劑或阻斷PKCδ核轉(zhuǎn)位對(duì)TRB3過表達(dá)所致β細(xì)胞凋亡的影響。
　　體

10、內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.建立腎包膜下β細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型:首先，用STZ處理免疫缺陷小鼠，建立糖尿病模型。待血糖顯著升高后，將TRB3細(xì)胞移植入模型動(dòng)物腎包膜下。當(dāng)血糖開始降低后按照實(shí)驗(yàn)分組分別給予PA/Dox腹腔注射8天處理。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分別留取小鼠血清檢測(cè)各組小鼠血胰島素水平。
　　2.采用免疫組織化學(xué)染色觀察移植瘤中TRB3表達(dá)差異，并用TUNEL染色比較移植瘤中β細(xì)胞的凋亡差異。
　　3.用PKCδ抑制劑rottler

11、in驗(yàn)證在體內(nèi)PKCδ是否參與TRB3調(diào)控的胰島β細(xì)胞脂性凋亡:β細(xì)胞移植瘤模型小鼠在給予PA和/或Dox之前給予rottlerin預(yù)處理，用TUNEL染色分析比較PKCδ抑制劑對(duì)移植瘤中β細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果
　　第一部分游離脂肪酸對(duì)胰島β細(xì)胞TRB3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　1.高濃度血清游離脂肪酸誘導(dǎo)小鼠胰島細(xì)胞凋亡
　　連續(xù)7天腹腔注射PA后，小鼠血清游離脂肪酸(FFA)相較于對(duì)照組顯著升高，Caspas

12、e3/7蛋白酶活性增加(P＜0.01)。
　　2.游離脂肪酸誘導(dǎo)小鼠胰島TRB3及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)
　　Real-timePCR結(jié)果顯示游離脂肪酸處理組小鼠TRB3及CHOP、ATF4mRNA表達(dá)水平相較于對(duì)照組均顯著增加(P＜0.01);Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示TRB3及CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　3.游離脂肪酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)時(shí)間及濃度梯度依賴性
　　TUNEL染色結(jié)果顯示游離脂肪

13、酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡具有明顯的劑量依賴性及時(shí)間依賴性關(guān)系。
　　4.游離脂肪酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞TRB3、CHOP、ATF4的表達(dá)上調(diào)
　　Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PA孵育時(shí)間超過12小時(shí)后，TRB3、CHOP、ATF4的mRNA表達(dá)水平隨誘導(dǎo)時(shí)間及PA濃度的增加而逐漸升高。同時(shí)，我們采用Westernblot檢測(cè)了TRB3及CHOP的蛋白表達(dá)水平，TRB3、CHOP的蛋白表達(dá)水平隨誘導(dǎo)時(shí)間及PA濃度的增加

14、而上調(diào)。
　　5.敲降CHOP基因可以抑制游離脂肪酸刺激引起的TRB3上調(diào)及β細(xì)胞凋亡
　　采用siRNA干擾技術(shù)沉默了CHOP基因的表達(dá)，Westernblot結(jié)果顯示siCHOP顯著地抑制了由PA誘導(dǎo)的CHOP及TRB3蛋白的表達(dá)上調(diào)。TUNEL染色顯示，敲降CHOP后，由游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著減輕。
　　第二部分TRB3參與調(diào)控游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡
　　1.可誘導(dǎo)的TRB3細(xì)胞的建立鑒定

15、r>　　利用Tet-on系統(tǒng)成功構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)TRB3的胰島β細(xì)胞系。經(jīng)Real-timePCR、Westernblot及細(xì)胞免疫熒光染色證實(shí)，該細(xì)胞系由強(qiáng)力霉素500ng/ml誘導(dǎo)48小時(shí)后，TRB3表達(dá)水平顯著升高。
　　2.TRB3過表達(dá)引起胰島β細(xì)胞凋亡并加重了游離脂肪酸引起的β細(xì)胞凋亡
　　Caspase-3活性檢測(cè)、TUNEL染色及AnnexinV-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，TRB3細(xì)胞經(jīng)Dox誘導(dǎo)后，其細(xì)胞凋

16、亡率增加。同時(shí)，TRB3的過表達(dá)加重了PA刺激引起的β細(xì)胞凋亡。
　　3.敲降TRB3基因可以明顯抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡
　　采用siRNA干擾技術(shù)敲降INS-1細(xì)胞及TRB3細(xì)胞的TRB3基因，Caspase-3活性檢測(cè)及TUNEL染色結(jié)果顯示敲降TRB3基因可以明顯減少游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。
　　4.TRB3通過PKCδ通路介導(dǎo)了游離脂肪酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡
　　伴隨著TRB3的過表達(dá)，P

17、KCδ磷酸化水平增加其核轉(zhuǎn)位顯著增加，而敲降TRB3后，PKCδ活性及核蓄積降低。用PKCδ抑制劑或阻斷PKCδ的核轉(zhuǎn)位都顯著地降低了過表達(dá)TRB3引起的細(xì)胞凋亡，而對(duì)TRB3的表達(dá)水平無顯著影響。由此，我們認(rèn)為TRB3通過PKCδ通路介導(dǎo)了游離脂肪酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。
　　5.在體內(nèi)，TRB3通過PKCδ通路介導(dǎo)了游離脂肪酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡
　　建立免疫缺陷糖尿病小鼠腎包膜下胰島β細(xì)胞移植瘤模型，在該模型上證實(shí)，體內(nèi)TRB

18、3過表達(dá)誘導(dǎo)了胰島β細(xì)胞凋亡，同時(shí)TRB3過表達(dá)加重了胰島β細(xì)胞的脂性凋亡。應(yīng)用該動(dòng)物模型，證實(shí)PKCδ特異性抑制劑rottlerin能夠顯著降低由TRB3過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論
　　1.游離脂肪酸通過CHOP/ATF4途徑誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞中TRB3上調(diào)表達(dá)。
　　2.TRB3通過PKCδ通路參與調(diào)控游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。
　　研究意義
　　本研究首次闡明TRB3介導(dǎo)了脂毒性導(dǎo)致的胰島β細(xì)