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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分 抑制糖原合成酶激酶3 活性對(duì)油酸誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的作用
【背景】近年來隨著兒童肥胖癥發(fā)病率明顯升高,在世界范圍內(nèi)兒童肥胖已成為一種新的流行病,并導(dǎo)致與之相關(guān)的兒童2 型糖尿病發(fā)病率增加。而兒童2 型糖尿病的增多將嚴(yán)重影響全人類的健康狀況,其并發(fā)癥將會(huì)對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重影響。2 型糖尿病患者β細(xì)胞凋亡是其重要的發(fā)病機(jī)制,而糖原合成酶激酶3(GSK-3)被認(rèn)為是一些凋亡信號(hào)途徑的重要組成部分。
2、 【目的】本試驗(yàn)以油酸(OA)為凋亡誘導(dǎo)劑,觀察GSK-3在大鼠胰島INS-1細(xì)胞凋亡中活性的改變,探討在此凋亡模型下GSK-3是否參與胰島β細(xì)胞凋亡以及GSK-3 抑制劑(氯化鋰,LiCl)對(duì)β細(xì)胞凋亡的作用。
【方法】應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀、免疫印跡法觀察不同濃度OA 處理下INS-1細(xì)胞(大鼠β細(xì)胞系)凋亡率的改變以及GSK-3 磷酸化程度的變化,并用LiCl 抑制GSK-3的活性后再檢測(cè)INS-1細(xì)胞凋亡率的改變
3、以及GSK-3 磷酸化程度的變化。
【結(jié)果】用不同濃度的OA(0—0.6mM)可誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞發(fā)生凋亡,而隨著OA濃度增加,INS-1細(xì)胞凋亡率亦增加。OA 濃度為0.2mmol/L 時(shí),INS-1細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯的凋亡,OA 濃度增加至0.4mmol/L 時(shí),INS-1細(xì)胞出現(xiàn)最大的凋亡百分?jǐn)?shù),但隨著OA 濃度進(jìn)一步提高,INS-1細(xì)胞的凋亡不再隨之明顯增加。隨后應(yīng)用0.4mmol/LOA 處理INS-1細(xì)胞,GSK
4、-3 磷酸化程度較正常組明顯降低,但總GSK-3 含量并無明顯改變,提示GSK-3 活性明顯升高。而加入不同濃度的LiCl(0-36mM)時(shí),隨著LiCl濃度的增加,INS-1細(xì)胞的凋亡率逐漸減少,在用24mmol/L的LiCl 對(duì)GSK-3的活性進(jìn)行抑制后,INS-1細(xì)胞的凋亡率明顯下降。
【結(jié)論】 0.4mmol/L的OA 可通過激活GSK-3 來誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞(INS-1)發(fā)生最大程度凋亡,而加入LiCl 可通過抑制
5、GSK-3 活性在一定的程度上減少因OA 誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。說明GSK-3在OA 誘導(dǎo)胰島INS-1細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用,而通過抑制GSK-3的活性對(duì)OA 誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡能夠起到一定保護(hù)作用。本研究為2 型糖尿病的治療提供新的理論基礎(chǔ),并為其藥物開發(fā)提供一個(gè)可能的靶點(diǎn)。
第二部分PERK 激活在油酸引起的糖原合成酶激酶3 活化中的作用
【目的】?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是2 型糖尿病胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要
6、機(jī)制,PERK是一種重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度活化可以持久的激活PERK 從而引起細(xì)胞凋亡。在前期的工作中已發(fā)現(xiàn)FFAs 通過活化GSK-3 導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡,而長(zhǎng)時(shí)間暴露于FFAs 可引起胰島β細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究旨在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和GSK-3在胰島β細(xì)胞凋亡中的作用并探討其可能的信號(hào)通路。
【方法】采用Western Blot 法分別檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)因子和激酶在OA 處理前后的變化,明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是
7、否參與OA 誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。同時(shí)用ELISA法檢測(cè)PERK和AMPK 兩種激酶在OA 處理后活性的改變。然后分別抑制PERK和AMPK的活性,再用Western Blot 法檢測(cè)GSK-3 活性的變化,此時(shí)用Compound C 來抑制AMPK的活性,而PERK 活性的抑制是通過過表達(dá)P58IPK 質(zhì)粒來完成。最后采用免疫共沉淀和直接細(xì)胞熒光免疫法確定PERK和GSK-3是否存在共同作用。
【結(jié)果】
1
8、.OA誘導(dǎo)胰島INS-1細(xì)胞凋亡對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)因子和激酶的影響加入0.4mM OA后,GRP78、ATF6、XBP1、PERK和AMPK的表達(dá)水平均增加,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均具有顯著性差異。
2.ELISA法測(cè)定PERK和AMPK的活性加入OA后用ELISA試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PERK和AMPK的活性均增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.分別抑制PERK和AMPK活性對(duì)GSK-3活性的影響:(1)OA處理后,GSK-3
9、β活性較對(duì)照組增強(qiáng),統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異;(2)在加入OA后單獨(dú)抑制PERK活性,GSK-3活性較OA組降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異;3)加入OA后單獨(dú)給予AMPK抑制劑,GSK-3活性較OA組無明顯變化,較空白組明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。由于PERK的抑制是通過過表達(dá)P58(IPK)質(zhì)粒而實(shí)現(xiàn)的,因此用Flag的抗體進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染P58(IPK)質(zhì)粒時(shí),F(xiàn)lag顯色增強(qiáng),而其他均無顯色,說明轉(zhuǎn)染成功。
4.PER
10、K和GSK-3免疫共沉淀結(jié)果結(jié)果提示PERK和GSK-3存在直接作用。
5.PERK和GSK-3在OA誘導(dǎo)胰島INS-1細(xì)胞中共定位結(jié)果用FITC標(biāo)記PERK(顯色為綠色),羅丹明標(biāo)記GSK-3β(顯色為紅色),重疊后發(fā)現(xiàn)PERK和GSK-3β有明顯共定位。
【討論】長(zhǎng)時(shí)間暴露于游離脂肪酸可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑活化GSK-3 誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物PERK在這一過程中可以通過直接和GSK-
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