三(2-氯乙基)磷酸酯致肝細胞毒性的分子調控機制.pdf

1、三（2-氯乙基）磷酸酯（tris(2-chloroethyl) phosphate，TCEP）是一種常用的阻燃劑和增塑劑。由于TCEP以非共價鍵的方式結合在高分子材料中，因而極易逸出進入環(huán)境。目前，環(huán)境樣品（室內空氣、飲用水和室內灰塵等）和生物樣品（斑馬魚、海鷗和人母乳）中已檢出 TCEP。實驗研究表明，TCEP有神經毒性、生殖毒性和內分泌毒性，并可致小鼠肝臟腫瘤。但是，TCEP致肝毒性作用的機制仍不清楚。
　　外源性毒物侵入機體

2、后常誘導過量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成，繼而導致蛋白質、DNA、多醣體和脂類等大分子物質的損傷。線粒體是內源性ROS產生與代謝的主要場所，最先受ROS攻擊，因而影響細胞的正常分裂和生長，導致細胞的正常生理功能發(fā)生紊亂。在調節(jié)細胞生長的多條信號通路中，PI3K/Akt/mTOR通路是重要的信號通路之一。PI3K被ROS激活后可使膜磷酸肌醇發(fā)生磷酸化，繼而與Akt的PH區(qū)結合促發(fā)Akt磷酸化,促

3、發(fā)Akt下游分子事件來調節(jié)細胞的分裂與生長。
　　不可逆的細胞生長阻滯是細胞衰老的重要表型。氧化應激、線粒體損傷、端粒變短和DNA損傷等經p53-p21-Rb信號通路、DNA損傷反應信號通路和NFκB信號通路調控導致細胞衰老。本文旨在研究 TCEP的肝細胞毒性、線粒體毒性以及PI3K/Akt/mTOR通路和p53-p21-Rb通路在TCEP致肝細胞生長阻滯中的調控機制，為闡明TCEP致肝毒性的分子機制提供科學依據。
　　第一

4、部分 TCEP致肝細胞毒性的研究
　　目的：研究TCEP的肝細胞毒性。
　　方法：用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（終濃度<0.1％，溶劑對照）分別處理張氏人肝細胞、人胚肝細胞（L02）和人肝腫瘤細胞（HepG2）24h和48h。檢測細胞活力、乳酸脫氫酶釋放率、細胞色素P4501A1和3A4酶活力、評價細胞氧化應激（包括胞內ROS、丙二醛、谷胱甘肽過氧化物

5、酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和還原型胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）以及細胞增殖率、細胞周期分布和凋亡率。
　　結果：①TCEP處理三種細胞株24h和48h，張氏人肝細胞所有處理組的細胞活力均下降（P<0.05或P<0.01），但L02細胞僅有200mg/L TCEP處理組的細胞活力分別降至81.64%（P<0.05）和75.80%（P<0.01），HepG2細胞僅在200.00mg/L TCEP處理組細胞活力降至87.30%（P<0.

6、05）和88.49%（P<0.01）；②TCEP處理張氏肝細胞24h，所有處理組細胞LDH釋放率升高（P<0.05），在48h僅200mg/L TCEP的細胞LDH釋放率為0.48（P<0.05）。TCEP處理L02細胞24h，所有處理組細胞LDH釋放率升高（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L處理組細胞LDH釋放率均升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h，所有處理組細胞LDH釋放率

7、均升高（P<0.05）），在48h，≥12.50mg/L處理組細胞LDH釋放率升高（P<0.05或P<0.01）；③TCEP處理張氏肝細胞24h，僅200.00mg/L處理組的胞內ROS水平升高（P<0.05）。TCEP處理L02細胞24h，僅200.00mg/L處理組的胞內ROS水平升高（P<0.05），在48h，50.00mg/L和200.00mg/L處理組的胞內ROS水平升高（P<0.05）。TCEP處理HepG2細胞24h，50

8、.00mg/L和200.00mg/L處理組胞內ROS水平升高（P<0.05），但在48h，僅200.00mg/L處理組胞內ROS水平升高（P<0.05）；④TCEP處理張氏肝細胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組GSH/GSSG比值均升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02細胞24h，僅200.00mg/L處理組的GSH/GSSG比值升高（P<0.05），但在48h所有處理組GSH/GSSG比值均無顯著性變化。TC

9、EP處理HepG2細胞24h和48h，所有處理組GSH/GSSG比值均升高（P<0.05或P<0.01）；⑤TCEP處理張氏肝細胞24h，≥12.50mg/L處理組的細胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01），不過在48h則所有處理組細胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02細胞24h和48h，所有處理組細胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h和48h，僅200.00m

10、g/L TCEP處理組細胞增殖受到抑制（P<0.05）；⑥TCEP處理三個細胞株24和48h,所有處理組均未見細胞凋亡。但TCEP處理張氏細胞24h，3.12mg/L和50.00mg/L處理組細胞周期均阻滯在G2/M期（P<0.05），在48h所有處理組細胞周期均阻滯在G2/M期（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02細胞24h，3.12mg/L和200.00mg/L處理組細胞周期阻滯在G2/M期（P<0.05），在48h所有

11、處理組均未見細胞周期分布變化。TCEP處理HepG2細胞24h，除200.00mg/L外，其他處理組細胞周期均阻滯在G2/M期（P<0.05或P<0.01），在48h僅200.00mg/L處理組細胞周期阻滯在G0/G1期（P<0.05）。
　　結論：TCEP導致了肝細胞氧化抗氧化失衡，抑制了細胞生長，但未致細胞凋亡。
　　第二部分 TCEP促發(fā)線粒體信號通路致細胞生長阻滯的調控機制
　　目的：研究線粒體、Sirtuin

12、s及PI3K/Akt/mTOR通路在TCEP致肝細胞生長阻滯的調控機制，并揭示SIRT1在TCEP致L02細胞和HepG2細胞生長抑制中的調控機制。方法：用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（終濃度<0.1%，溶劑對照）分別處理L02細胞和HepG2細胞24h和48h，評價細胞線粒體功能（線粒體內ROS水平、線粒體膜電位、線粒體DNA拷貝數目、細胞內ATP水平和胞內游離C

13、a2+水平）、Sirtuins蛋白的mRNA和蛋白表達水平以及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達。用SIRT1抑制劑EX-527與TCEP共處理細胞，測定細胞增殖率和PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白的表達。
　　結果：①TCEP分別處理L02細胞和HepG2細胞24h和48h，兩個細胞株的所有處理組細胞生長率均降低（P<0.05或P<0.01）；②TCEP處理L02細胞24h，≥12.50mg/L處理組胞內T-

14、AOC水平均升高（P<0.05或P<0.01），在48h，則≥50.00mg/L處理組胞內T-AOC水平升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h，≥50.00mg/L處理組的胞內T-AOC水平均升高（P<0.05），在48h，≥3.12mg/L處理組胞內T-AOC水平均升高（P<0.05或P<0.01）；③TCEP處理L02細胞24h和48h，僅在48h發(fā)現50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處

15、理組胞內mtROS水平升高（P<0.05，P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h和48h，≥12.50mg/L TCEP處理組胞內mtROS含量均升高（P<0.05，P<0.01）；④TCEP處理L02細胞和HepG2細胞24h和48h，兩個細胞株所有處理組的mtDNA數目均下降（P<0.05或P<0.01）；⑤TCEP處理L02細胞和HepG2細胞24h和48h，兩個細胞株都僅在24h可見所有處理組MMP下降（P<0.05或

16、P<0.01）；⑥TCEP處理L02細胞24h和48h，僅200.00mg/L處理組胞內ATP水平降低（P<0.05）。TCEP處理 HepG2細胞24h，50.00mg/L和200.00mg/L處理組胞內 ATP水平降低（P<0.05），但在48h各處理組未見胞內ATP水平的變化（P>0.05）；⑦TCEP處理L02細胞24h和48h，50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內游離 Ca2+水平均升高（P<0.05，

17、P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h和48h，在24h僅200.00mg/L TCEP處理胞內游離Ca2+水平升高（P<0.05），但在48h可見50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內游離 Ca2+水平均升高（P<0.01）；⑧TCEP處理 L02和HepG2細胞24h，>3.12mg/L處理組SIRT1基因mRNA表達均上調（P<0.05或P<0.01），在48h所有處理組的SIRT1基因mRNA表達

18、均上調（P<0.05或P<0.01）；⑨TCEP處理L02細胞24h和48h，所有處理組SIRT2基因mRNA表達下調（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h和48h，>3.12mg/L處理組SIRT2基因mRNA表達下調（P<0.05或P<0.01）；⑩TCEP處理L02細胞24h，所有處理組SIRT3基因mRNA表達均下調（P<0.05或P<0.01），在48h，>3.12mg/L處理組SIRT3基因mRNA

19、表達均下調（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h，所有處理組SIRT3基因mRNA表達均下調（P<0.05或P<0.01），在48h，>3.12mg/L處理組SIRT3基因mRNA表達均下調（P<0.05或P<0.01）；○11 TCEP處理L02細胞24h和48h，所有處理組SIRT1蛋白表達均上調，但是SIRT3蛋白表達均下調，不過僅在200mg/L TCEP處理組可見SIRT2蛋白表達下調。TCEP處理H

20、epG2細胞24h和48h，所有處理組細胞SIRT1蛋白表達均上調，但SIRT3蛋白表達均下調，SIRT2蛋白表達變化不明顯；○12 TCEP處理L02細胞24h，≥12.5mg/L處理組SIRT1蛋白表達均上調（P<0.05或P<0.01），在48h，所有處理組SIRT1蛋白表達均上調（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h和48h，所有處理組SIRT1蛋白表達均上調（P<0.05或P<0.01）；○13 TC

21、EP處理L02細胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達均下調。TCEP處理HepG2細胞24h和48h，所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達均下調；○14 TCEP處理L02細胞24h，≥50.00mg/L處理組的細胞增殖受抑制（P<0.05或 P<0.01），在48h，≥12.50mg/L處理組細胞增殖均受抑

22、制（P<0.05或P<0.01）。TCEP與EX-527共處理L02細胞24h和48h，所有處理組的細胞增殖均受抑制（P<0.01）。TCEP處理HepG2細胞24h，≥12.50mg/L處理組細胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01），在48h僅200.00mg/L處理組細胞增殖受抑制（P<0.05）。TCEP與EX-527共處理HepG2細胞24h，≥12.50mg/L處理組細胞增殖均受抑制（P<0.05或 P<0.01），在4

23、8h，所有處理組細胞增殖均受抑制（P<0.05或 P<0.01）；○15 TCEP和EX-527共處理L02細胞24h和48h，所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達均下調。TCEP和EX-527共處理HepG2細胞24h和48h，所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達均下調。
　　結論：TCEP致肝細胞線粒體損傷及線粒體功能紊亂，消弱 SIRT1非依賴性PI3K/A

24、kt/mTOR信號通路，最終導致肝細胞生長阻滯。
　　第三部分 TCEP激活p53非依賴p21/Rb通路致細胞衰老樣生長阻滯的調控機制
　　目的：研究TCEP致肝細胞衰老及其p53-p21-Rb信號通路的調控機制。
　　方法：用RNA干擾技術沉默L02細胞中p53蛋白表達，建立L02-p53細胞模型。用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（終濃度<0.1%

25、，溶劑對照）分別處理L02細胞、L02-p53細胞和Hep3B（p53缺失細胞株）細胞24h和48h，對比性研究衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）陽性細胞率，IL-6分泌水平，以及p53、MDM2、Rb、p-Rb、Ras、p21、IL6R、p38MAPK、p-p38MAPK、NFkB和p-NFkB蛋白表達。
　　結果：①TCEP處理 L02細胞24h和48h，所有處理組的 SA-β-Gal陽性細胞率升高（P<0.05或P<

26、0.01）。TCEP處理L02-p53細胞24h，≥12.50mg/L處理組SA-β-Gal陽性細胞率均升高（P<0.05或P<0.01），在48h所有處理組 SA-β-Gal陽性細胞率均升高（P<0.01），陰性對照組與溶劑對照組相比無顯著性差異。TCEP處理Hep3B細胞24h和48h，所有處理組的SA-β-Gal陽性細胞率均升高（P<0.05或P<0.01）；②TCEP處理L02細胞24h，≥12.50mg/L處理組IL-6水平均

27、降低（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L處理組IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02p53-細胞24h，≥12.50mg/L處理組的IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L處理組IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理Hep3B細胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）

28、；③TCEP處理L02細胞24h和48h，所有處理組 MDM2蛋白的表達均上調，p53蛋白表達均下調；≥50.00mg/L處理組p38MAPK、p-p38MAPK、NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表達均下調；所有處理組Rb和p-Rb蛋白表達上調；≥12.50 mg/L處理組p21蛋白表達均上調。TCEP處理L02-p53細胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達均下調，≥50.00mg

29、/L處理組NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表達均下調；所有處理組的Rb、p-Rb和p21蛋白表達均上調。TCEP處理 Hep3B細胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組p38MAPK、p-p38MAPK和IL6R蛋白表達均下調；所有處理組NFκB和p-NFκB蛋白表達均下調，Rb、p-Rb和p21蛋白表達均上調。
　　結論：TCEP誘導肝細胞衰老樣生長阻滯可能由p53非依賴性p21/Rb信號通路調控。但未見IL-6/IL