三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的nucleolin自調(diào)控機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)是一種環(huán)境化學(xué)污染物，它主要通過呼吸道吸入和皮膚吸收進(jìn)入機體產(chǎn)生危害。盡管隨著用途的變化及替代化合物的廣泛使用，人們對三氯乙烯在工業(yè)生產(chǎn)中職業(yè)暴露的機會越來越少，然而其對地下水源的污染卻正在成為一個非常重要的環(huán)境問題，因此在日常生活中，三氯乙烯暴露的風(fēng)險其實并未減少。肝臟是三氯乙烯在體內(nèi)的重要代謝場所和和主要受損器官之一。
　　在前期工作中，課題組已利用

2、人正常肝細(xì)胞（HL-7702，簡稱L-02）研究三氯乙烯的肝細(xì)胞毒性機制，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選了三氯乙烯誘導(dǎo)L-02細(xì)胞中的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)SET蛋白在L-02細(xì)胞中與三氯乙烯染毒劑量呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。通過構(gòu)建SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，SET蛋白介導(dǎo)了三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞毒性。
　　SET蛋白是生命進(jìn)程中的一個重要因子，它參與了眾多關(guān)鍵的生物過程，包括細(xì)胞凋亡、核小體組裝、染色質(zhì)重構(gòu)等，同時它還是真核細(xì)胞

3、中重要的組蛋白分子伴侶，它不僅僅參與染色質(zhì)重構(gòu)，還是組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶抑制因子的重要組成部分，并參與組蛋白乙?；揎椀囊种七^程。SET蛋白也是一個與腫瘤密切相關(guān)的蛋白，有多種研究表明SET蛋白參與腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤形成。SET蛋白也是細(xì)胞中重要的內(nèi)源性去磷酸化修飾酶——磷酸酯酶2A(Phosphotase2A，PP2A)特異性的抑制因子，盡管SET蛋白特異性地抑制PP2A的活性，它卻可以在二價錳離子存在的條件下激活磷酸酯酶1。由此可見

4、，SET蛋白在細(xì)胞中最重要的生物學(xué)過程，磷酸化修飾中扮演著關(guān)鍵角色，并且起到相當(dāng)重要的作用。
　　蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在真核細(xì)胞的生命進(jìn)程中分子調(diào)控與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到了最基本也是最重要的作用。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是通過蛋白激酶將三磷酸腺苷(ATP)上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白的特定氨基酸殘基上。蛋白質(zhì)的某種活性就能夠通過這樣的反應(yīng)將一個或多個特點位點的磷酸化修飾被激活或抑制，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、代謝、細(xì)胞周期、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞免疫

5、等過程。
　　盡管SET蛋白在蛋白磷酸化修飾中具有重要地位，它參與磷酸化修飾的分子機制及生物學(xué)意義仍然未被完全闡明。本研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討SET蛋白介導(dǎo)的三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中蛋白磷酸化變化及其生物學(xué)意義。利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選在L-02細(xì)胞中與三氯乙烯毒性相關(guān)以及SET介導(dǎo)的磷酸化蛋白，然后進(jìn)一步探討了SET蛋白參與nucleolin的整體磷酸化修飾及其自調(diào)控機制。
　　方法:
　　一、三氯乙烯誘導(dǎo)的L-

6、02肝細(xì)胞毒性中磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與染毒處理
　　L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞在37℃，5％CO2條件下，分別用含12％FBS，1％雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)于75 cm2細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70％以上時，分別對L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞進(jìn)行三氯乙烯染毒處理24h，染毒濃度為1/2IC50值(16 mmol/L)，即8 mmol/L。<

7、br>　　2.蛋白提取及蛋白酶解
　　染毒處理后消化細(xì)胞，用PBS洗滌三次，用PhosphoSafe磷酸化蛋白裂解液重懸并裂解細(xì)胞，高速離心后取含蛋白粗提物的上清液。用Thermo BCAQuantification kit對樣品總蛋白進(jìn)行定量后每個樣品取出100μg，利用TEAB緩沖液及超濾離心管進(jìn)行溶液置換，二硫鍵還原及烷基化反應(yīng)，然后每個樣品分別加入1μg胰蛋白酶，37℃進(jìn)行過夜酶解。
　　3.iTRAQ標(biāo)記、磷酸化多

8、肽富集以及樣品脫鹽處理
　　酶解產(chǎn)物經(jīng)凍干及重溶，利用iTRAQ標(biāo)記物(113，114，115，116，121)分別針對不同實驗重復(fù)及不同組的樣品進(jìn)行標(biāo)記（121標(biāo)記所有組混合而成的內(nèi)標(biāo)），然后用超純水終止標(biāo)記。標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行混合后再經(jīng)冷凍干燥，利用基于二氧化鈦(TiO2)的IMAC技術(shù)對磷酸化多肽進(jìn)行富集，并洗脫非磷酸化多肽。所得富集產(chǎn)物再利用C18填充的固相萃取柱進(jìn)行脫鹽處理。
　　4.液相分離及質(zhì)譜檢測
　　利用水

9、相為流動相，用C18富集柱對多肽樣品進(jìn)行富集，然后用5-55％梯度的乙腈在C18分析柱中洗脫樣品90min。多肽經(jīng)NanosprayⅢ source被電離及霧化后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測，收集母離子及子離子信號，經(jīng)過ProteinPilot Softwarev.4.5軟件進(jìn)行離子峰提取，然后利用Mascot引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，并生成隨機序列的誘餌庫將假陽性率控制在1％之內(nèi)。
　　5.相對定量及生物信息學(xué)分析
　　從所有鑒定的磷

10、酸化多肽中篩選出在三次實驗重復(fù)中都出現(xiàn)的多肽，然后將報告離子信號與內(nèi)標(biāo)均一化。以同一蛋白的不同磷酸化多肽的母離子信號峰面積為權(quán)重，再取均一化后帶權(quán)重的iTRAQ報告離子強度平均值，每條磷酸化多肽報告離子強度除以其平均值得到相對磷酸化多肽強度，以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)再進(jìn)行min/max轉(zhuǎn)換（-1到1之間），然后進(jìn)行單因素方差分析。對差異的磷酸化蛋白利用R語言clusterProfiler包分別對其進(jìn)行KEGG通路富集以及GO功能富集。
　　

11、6.差異磷酸化修飾的Western-blot驗證
　　收集染毒處理的正常L-02細(xì)胞及SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，等量上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后，將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再分別孵育nucleolin、4E-BP1(phosphoT46)、MCM2、MCM2(phospho S139)以及GAPDH抗體，然后加相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育，最后將PVDF膜進(jìn)行曝光、圖

12、像處理及統(tǒng)計學(xué)分析。
　　二、三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的nucleolin自調(diào)控機制研究
　　1.Western-blot驗證nucleolin整體磷酸化及其表達(dá)水平變化
　　收集染毒處理的正常L-02細(xì)胞及SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，等量上樣進(jìn)行Phos-tag-SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再分別孵育nucleolin

13、以及GAPDH抗體，然后加相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育，最后將PVDF膜進(jìn)行曝光、圖像處理及統(tǒng)計學(xué)分析。
　　2.C-myc被抑制后nucleolin在L-02細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　L-02細(xì)胞在37℃，5％CO2條件下分別貼壁培養(yǎng)于六孔板中，待融合度達(dá)到75％以上，加入不同濃度(0μM、20μM、40M、80μM、100μM)的c-myc抑制劑處理24h，然后用Western-blot分別檢測c-myc與nucleolin蛋白表達(dá)水平

14、的變化。
　　3.在三氯乙烯作用下SET介導(dǎo)的c-myc與nucleolin相互作用的變化
　　收集染毒處理的正常L-02細(xì)胞及SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。按照Co-IP試劑盒說明，將nucleolin與c-myc抗體分別與A/G Plus瓊脂柱進(jìn)行結(jié)合，使抗體交聯(lián)在瓊脂柱上，每組等量上樣后，分別以nucleolin與c-myc為誘餌蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實驗，被沉淀的蛋白用Western

15、-blot分別檢測c-myc與nucleolin水平變化。
　　三、三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
　　1.細(xì)胞處理、熒光標(biāo)記及芯片雜交
　　L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞分別用8 mM三氯乙烯處理24小時，收集細(xì)胞，提取總RNA，按照Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit、EukaryoticHybridization Control K

16、it、Hybridization，Wash，and Stain Kit試劑盒說明配制所需熒光標(biāo)記及清洗試劑，然后進(jìn)行熒光標(biāo)記、雜交及掃描。
　　2.質(zhì)量控制、相對定量及通路變異分析
　　利用R語言包Affy進(jìn)行質(zhì)量控制。不同探針針對同一個基因取信號強度的中位數(shù)，同一個基因不同轉(zhuǎn)錄本取信號強度的總和，然后利用線性模型及貝葉斯統(tǒng)計檢驗對基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對定量分析。為了進(jìn)一步探索SET可能介導(dǎo)的通路變化，利用基因集變異分析(GS

17、VA)算法篩選被激活/抑制的通路。
　　結(jié)論:
　　1.鑒定了107個磷酸化蛋白以及1878個磷酸化位點，其中38個磷酸化蛋白的51個位點的磷酸化修飾在不同組中均發(fā)生了不同程度的改變，其中SET介導(dǎo)了13個蛋白的14個磷酸化位點改變。并驗證了三氯乙烯誘導(dǎo)的4E-BP1(T46)和MCM2(S139)磷酸化修飾的變化。
　　2.SET在三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞毒性中介導(dǎo)了nucleolin的整體磷酸化修飾，并以此影響n