1-甲脲乙醇酸酐、甲基胍對HK-2細胞的凋亡、纖維化相關(guān)因子表達及藥物干預的研究.pdf

1、第一部分1．甲脲乙醇酸酐對人腎小管上皮細胞的凋亡、纖維化相關(guān)因子表達及其干預因素的體外研究 目的：研究1．甲脲乙醇酸酐對人腎小管上皮細胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達的影響，以及PGEl和普羅布考的干預作用。 方法： 1．培養(yǎng)HK-2細胞； 2．不同濃度1-甲脲乙醇酸酐分組與HK-2細胞共同培養(yǎng)，用MTT比色試驗法、檢測NAG酶釋放、Hoechst染色及Annexin V-FITC／PI流式細胞檢測凋亡，來觀察

2、其對HK-2細胞的毒性作用；通過免疫細胞化學、RT-PCR檢測TGF-β1、CTGF和FN，并進一用流式細胞儀對以上因子作定量檢測，以觀察其對HK-2細胞的促纖維化作用；并分別加入PGEl和普羅布考了解以上藥物對HK-2細胞的保護作用。 結(jié)果： 1．HK-2細胞加入肌酐、1-甲脲乙醇酸酐后，較正常對照組吸光度值顯著下降(P<0.01)，NAG酶濃度顯著上升(P<0.01)；0.5mMol／L1-甲脲乙醇酸酐加入PGEl、

3、普羅布考后，吸光度值顯著上升，NAG酶濃度顯著下降，PGEl改變幅度大于后者，有顯著性差異(P<0.01)。1-甲脲乙醇酸酐0.25mMol／L、O.5mMol／L和1mMol／L三個不同濃度組間有顯著性差異(P<0.01)，隨濃度下降，吸光度值上升，NAG酶濃度顯著下降。1-甲脲乙醇酸酐與同摩爾濃度肌酐比較，吸光度值顯著下降(P<0.01)，NAG酶濃度顯著下降。 2．HK-2細胞加入1-甲脲乙醇酸酐后，Hoechst3325

4、8染色顯示呈藍色的細胞核，凋亡細胞呈現(xiàn)核固縮，染色加深，并出現(xiàn)凋亡小體。 3．流式細胞術(shù)顯示甲脲乙醇酸酐組HK-2細胞凋亡率顯著高于對照組、肌酐組(P<0.01)。在甲脲乙醇酸酐中分別加入PGEl、普羅布考后，凋亡率顯著下降(P<0.01)，但PGEl下降幅度大于后者，兩者有顯著性差異(P<0.05)。肌酐組與對照組比較(P>0.05)，無顯著性差異，但前者凋亡率大于后者。 4．在1-甲脲乙醇酸酐刺激后，免疫細胞化學染色

5、，顯示TGF-β1、CTGF和FN均有強表達；流式細胞儀定量、RT-PCR顯示三者甲脲乙醇酸酐組顯著高于正常對照組和肌酐組(P<0.01)，加入PGEl、普羅布考后，表達顯著下降(P<0.01)，下降幅度PGEl顯著高于后者(P<0.01)。 結(jié)論： 1．肌酐降解為1-甲脲乙醇酸酐后，促腎小管上皮細胞凋亡、壞死作用顯著增強。 2．1-甲脲乙醇酸酐能顯著促進腎小管上皮細胞TGF-β1、CTGF和FN表達，提示有促腎

6、小管上皮細胞纖維化作用。 3．PGEl、普羅布考對1-甲脲乙醇酸酐損害腎小管上皮細胞有一定的阻止作用。 第二部分 甲基胍對人腎小管上皮細胞的凋亡、纖維化相關(guān)因子表達及其干預因素的體外研究 目的:研究甲基胍對人腎小管上皮細胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達的影響,以及PGEl和普羅布考的干預作用 方法: 1.培養(yǎng)HK-2細胞 2.不同濃度甲基胍分組與HK-2細胞共同培養(yǎng),用MTT比色試驗法、檢測N

7、AG酶釋放、Hoechst染色及Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測凋亡,來觀察其對HK-2細胞的毒性作用;通過免疫細胞化學、RT-PCR檢測FGF-β1、CTGF和Fn,并進一用流式細胞儀對以上因子作定量檢測,以觀察其對HK-2細胞的纖維化相關(guān)因子表達;并分別加入PGEl和普羅布考了解以上藥物對HK-2細胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達的影響。 結(jié)果: 1.HK-2細胞加入肌酐、甲基胍后,較正常對照組吸光度值顯著

8、下降(P<0.01),NAG酶濃度顯著上升(P<0.01);0.5mMol/L甲基胍加入PGEl、普羅布考后,吸光度值顯著上升,NAG酶濃度顯著下降,PGEl改變幅度大于后者,有顯著性差異(P<0.01)。甲基胍0.25mMol/L、0.5mMol/L和1mMol/L不同濃度組間有顯著性差異(P<0.01),隨濃度下降,吸光度值上升,NAG酶濃度顯著下降。甲基胍與同摩爾濃度肌酐比較,吸光度值顯著下降(P<0.01),NAG酶濃度顯著下降

9、。 2．HK-2細胞加入甲基胍后，Hoechst33258染色顯示凋亡細胞呈現(xiàn)核固縮，染色加深，并出現(xiàn)凋亡小體。 3．流式細胞術(shù)顯示甲基胍組HK-2細胞凋亡率顯著高于對照組、肌酐組(P<0.01)。在甲基胍中分別加PGEl、普羅布考后，凋亡率顯著下降(P<0.01)，PGEl但下降幅度大于后者，兩者有顯著性差異(P<0.05)。 4．在甲基胍刺激后，免疫細胞化學染色，顯示TGF-βl、CTGF和Fn均有強表達；流

10、式細胞儀定量、RT-PCR顯示三者甲基胍組顯著高于正常對照組和肌酐組(P<0.01)，加入XPGEl、普羅布考后，表達顯著下降(P<0.01)，下降幅度PGEl顯著高于后者(P<0.01)。 結(jié)論： 1．甲基胍有促進腎小管上皮細胞凋亡的作用，且較其前身物質(zhì)肌酐更強。 2．甲基胍有促進腎小管上皮細胞纖維化相關(guān)因子表達的作用。 3．PGEl、普羅布考對甲基胍所致腎小管上皮細胞凋亡及纖維化相關(guān)因子的表達有一定的