祛風(fēng)通竅方對血管性癡呆大鼠自噬、凋亡及血液流變學(xué)的影響研究.pdf

1、目的:通過對血管性癡呆(Vascular dementia，VD)模型大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(mi-crotubule-associated protein1 light chain3，MAP1-LC3,LC3)、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、自噬小體、細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptotic Index，AI)及血液流變學(xué)的觀察，研究祛風(fēng)通竅方對VD大鼠自噬、凋亡及血液流變學(xué)的影響，初步探討祛風(fēng)通竅方對VD大鼠的保護(hù)機制。
　　 方

2、法:1）動物分組:健康雄性SD大鼠90只，永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)法制備VD模型，以Morris水迷宮實驗作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將符合要求的SD大鼠按隨機對照表法分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（西藥組）、祛風(fēng)通竅方高劑量組（高劑量組）、祛風(fēng)通竅方中劑量組（中劑量組）、祛風(fēng)通竅方低劑量組（低劑量組）各12只。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動脈(Commoncarotid artery，CCA)不結(jié)扎。2）給藥:西藥組給予尼莫地平6.25mg/

3、kg/d濃度混懸液灌胃，高、中、低劑量組分別予以相當(dāng)于祛風(fēng)通竅方生藥26.8g/kg/d、13.4g/kg/d、6.7g/kg/d的濃縮液灌胃，假手術(shù)組、模型組予以生理鹽水灌胃，每天1次，每次3ml，連續(xù)喂養(yǎng)30天。3）標(biāo)本采集:1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉，仰臥固定，開胸，快速心臟取血(5ml)，注入抗凝管內(nèi)，用于血流變學(xué)檢測;隨機抽取5只大鼠斷頭處死，取新鮮腦組織PE管中-70℃保存?zhèn)溆?7只大鼠心臟灌注內(nèi)固定，斷頭取腦

4、，固定、脫水、包埋制成切片。4）觀察指標(biāo):Morris水迷宮試驗檢測VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能;電鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞超細(xì)微結(jié)構(gòu);Western Blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá);免疫組化檢測Beclin-1蛋白表達(dá);原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測海馬神經(jīng)元AI;流變快測儀檢測血液流變學(xué)指標(biāo)。
　　 結(jié)果:1）Morris水迷宮實驗:與假手術(shù)組比較，模型組及各藥物干預(yù)組逃避潛伏期（escape latency，EL）均延長，平臺象

5、限停留時間縮短，跨越虛擬平臺的次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，西藥組、高、中劑量組EL逐漸縮短，平臺象限停留時間延長，跨越虛擬平臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);低劑量組EL有所縮短，平臺象限停留時間有所延長，跨越虛擬平臺的次數(shù)有所增加，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與西藥組比較，高劑量組EL縮短，平臺象限停留時間延長，跨越虛擬平臺次數(shù)增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與低

6、劑量組比較，西藥組、高、中劑量組EL縮短，平臺象限停留時間延長，跨越虛擬平臺的次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。2)電鏡結(jié)果:電鏡觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞:模型組可見大量空泡，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜結(jié)構(gòu)不清，甚者核碎裂，細(xì)胞器明顯減少，線粒體明顯水腫，線粒體嵴雙層膜結(jié)構(gòu)不清，甚者固縮壞死;西藥組、高、中劑量組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核呈圓形，細(xì)胞器較豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微水腫，線粒體嵴可見，可見少量溶酶體;低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所改善，

7、但仍可見細(xì)胞核固縮碎裂，細(xì)胞器減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫。電鏡觀察皮層額葉神經(jīng)元細(xì)胞:模型組細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，甚者碎裂，細(xì)胞器明顯減少，線粒體固縮，嵴的雙層膜結(jié)構(gòu)消失;西藥組、高、中劑量組細(xì)胞核圓形，核膜清晰，細(xì)胞器較豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略顯水腫，溶酶體明顯。低劑量組與模型組比較有所改善，但仍見細(xì)胞核固縮，細(xì)胞器減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫。海馬及皮層均未見自噬小體結(jié)構(gòu)。3）LC3蛋白檢測:與假手術(shù)組比較，模型組及各藥物干預(yù)組LC3蛋白表達(dá)水

8、平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，各藥物干預(yù)組LC3蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與西藥組比較，高劑量組LC3蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中劑量組LC3蛋白表達(dá)雖有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與低劑量組比較，高、中劑量組LC3蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。4) Beclin-1蛋白檢測:與假手術(shù)組比較，模型組及各藥物干預(yù)組Beclin-

9、1蛋白平均光密度（Mean optical density，MOD）值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，西藥組、高、中劑量組Beclin-1蛋白MOD值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);低劑量組Beclin-1蛋白MOD值雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與西藥組比較，高劑量組Beclin-1蛋白MOD值升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與低劑量組比較，西藥組、高、中劑量組Beclin

10、-1蛋白MOD值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。5)海馬神經(jīng)元AI檢測:與假手術(shù)組比較，模型組及各藥物干預(yù)組AI均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，西藥組、高、中劑量組AI均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);低劑量組AI有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與西藥組比較，高劑量組AI降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與低劑量組比較，西藥組、高、中劑量組AI均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

11、0.05)。6)血液流變學(xué)指標(biāo)檢測:與假手術(shù)組比較，模型組及各藥物治療干預(yù)組全血粘度、血漿粘度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，各藥物干預(yù)組全血粘度、血漿粘度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與西藥組比較，高、中劑量組全血粘度、血漿粘度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，低劑量組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與低劑量組比較，高、中劑量組全血粘度、血漿粘度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。<