參麻益智方對血管性癡呆大鼠神經(jīng)血管單元的影響.pdf

1、血管性癡呆(vascular dementia VD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的老年期癡呆。隨著生活水平的不斷提高，人們的生活方式，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，導(dǎo)致腦血管病的發(fā)生率一直居高不下，因此VD的發(fā)病率也在逐年提高，流行病學(xué)調(diào)查顯示，歐美國家癡呆患者中的10％-20％為VD，在我國，VD的發(fā)病率為1.1％-3.0％，年發(fā)病率為5‰-9‰。血管性癡呆因其高發(fā)病率，高致殘率而嚴(yán)重影響老年人的身體健康和生活質(zhì)量，但其治療卻缺乏有效的方法

2、。因此，以從中醫(yī)藥中探索對血管性癡呆有效的治療方法為目的，我們開展了本項(xiàng)研究。
　　目的:
　　觀察中藥復(fù)方參麻益智方對VD模型大鼠包括血腦屏障、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)血管單元的影響，從而探索參麻益智方治療血管性癡呆的作用機(jī)制。
　　方法:
　　分組、造模與給藥
　　選用清潔級Wistar大鼠70只，雄性，10周齡，體重300±40g，將大鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為空白組、假手術(shù)組、模型組、多奈

3、哌齊組、參麻益智方中藥低劑量組，中藥中劑量組和中藥高劑量組。模型組、多奈哌齊組、中藥各組以大鼠自體微血栓栓塞法造成大鼠多梗死性癡呆模型;假手術(shù)組注射0.3ml生理鹽水，余同模型組。造模結(jié)束后多奈哌齊組予0.5mg/kg藥物灌胃，中藥低劑量組予藥物3.3mg/kg灌胃，中藥中劑量組予藥物6.6mg/kg灌胃，中藥高劑量組予藥物16.5mg/kg灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等量蒸餾水灌胃。每日灌胃一次，連續(xù)給藥4周。
　　實(shí)驗(yàn)一參麻益智

4、方對VD模型大鼠行為學(xué)及海馬病理形態(tài)的影響
　　1方法:
　　給藥結(jié)束后采用ZS-001型Morris水迷宮系統(tǒng)檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)第1-5日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，上午將大鼠從規(guī)定入水點(diǎn)放入水中，開始記錄，待大鼠爬上平臺（各部位都位于平臺上）為結(jié)束時間，每組依次進(jìn)行，每天從不同入水點(diǎn)重復(fù)四次后結(jié)束。第6日上午進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，從南側(cè)入水點(diǎn)放入大鼠，記錄大鼠穿過原來放置平臺位置的次數(shù)，第四象限活動時間以及第四象限活動路

5、程。
　　水迷宮結(jié)束后每組大鼠斷頭取全腦，固定、石蠟包埋、切片，行常規(guī)HE染色和尼氏染色。
　　2結(jié)果:
　　2.1空間探索實(shí)驗(yàn)
　　與空白組相比，假手術(shù)組大鼠各天的逃避潛伏期差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組大鼠各天的逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，多奈哌齊組與參麻益智方高、中劑量組大鼠各天的逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.

6、05)。
　　2.2定位航行實(shí)驗(yàn)
　　與空白組相比，假手術(shù)組大鼠的穿臺次數(shù)(passing platform times，PPT)與第四象限活動時間與路程的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義;與假手術(shù)組相比，模型組大鼠穿臺次數(shù)明顯減少，第四象限活動時間變短，第四象限活動路程減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，多奈哌齊組與參麻益智方中藥高劑量組穿臺次數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與假手術(shù)相比，多奈哌齊組與中藥

7、高劑量組第四象限活動路程增加;中藥組的第四象限活動時間雖然有增加的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.3 HE染色
　　100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)可見空白組及假手術(shù)組錐體細(xì)胞排列致密、有序、層次分明，細(xì)胞形狀規(guī)則，核仁清晰;模型組錐體細(xì)胞減少甚至消失，排列無序，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞形狀不規(guī)則;多奈哌齊及參麻益智方中藥高、中劑量組海馬的錐體細(xì)胞較模型組細(xì)胞數(shù)量增多，排列整齊，細(xì)胞間隙減小。
　　2.4尼氏(Niss

8、l)染色
　　100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)可見空白組、假手術(shù)組Nissl小體體積大，數(shù)量多，深染;模型組Nissl小體數(shù)量明顯減少、甚至消失，體積變小，染色變淺;多奈哌齊組及參麻益智方中藥高、中劑量組尼氏小體的數(shù)量、體積又有不同程度的增加，顏色加深。
　　3結(jié)論:
　　參麻益智方可改善VD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　參麻益智方可減輕VD模型大鼠海馬組織細(xì)胞的損傷。
　　實(shí)驗(yàn)二參麻益智方對VD模型大鼠

9、海馬組織NVU中血管新生的影響
　　1方法:
　　1.1 western blot法檢測VD大鼠海馬組織中HIF1α和Notch蛋白含量
　　1.2 ELISA法檢測VD模型大鼠海馬組織VEFG含量
　　1.3 RT-PCR法檢測VD模型大鼠海馬組織VEGF mRNA含量
　　1.4免疫組化法檢測VD大鼠海馬組織MVD
　　2結(jié)果:
　　2.1 HIF1α和Notch蛋白含量
　　與空白組

10、相比，假手術(shù)組的HIF1α、Notch蛋白的表達(dá)改變，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組的HIF1α、Notch的蛋白表達(dá)稍有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，多奈哌齊組HIF1α、Notch的蛋白表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，參麻益智方高、中劑量組均可提高HIF1α、Notch的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.2 VEFG含量
　　與空白組相

11、比，假手術(shù)組的VEGF表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組的VEGF的蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比，多奈哌齊組VEGF的蛋白表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，參麻益智方中藥高劑量組可顯著提高VEGF的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.3 VEGFmRNA含量
　　與空白組相比，假手術(shù)組的VEGFmRNA表達(dá)改變，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0

12、.05);與假手術(shù)組相比，模型組的VEGFmRNA的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比，多奈哌齊組VEGFmRNA的表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，參麻益智方中藥高劑量組可顯著提高VEGFmRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.4微血管密度(MVD)
　　200倍顯微鏡下觀察VD大鼠海馬組織CA1區(qū)，與空白組相比，假手術(shù)組的MVD改變，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)

13、;與假手術(shù)組相比，模型組的MVD升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比，多奈哌齊組MVD改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，參麻益智方中藥高劑量組可顯著提高M(jìn)VD，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3結(jié)論:
　　參麻益智方可以促進(jìn)VD模型大鼠海馬組織HIF1α、VEGF、Notch的蛋白表達(dá)。
　　參麻益智方對VD模型大鼠海馬組織VEGFmRNA的表達(dá)具有促進(jìn)作用。
　　參麻益智方

14、可提高VD大鼠海馬組織MVD。
　　實(shí)驗(yàn)三參麻益智方對VD模型大鼠海馬組織NVU神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　1.方法:
　　1.1 western blot檢測VD模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、caspase3蛋白表達(dá)
　　1.2 RT-PCR檢測VD模型大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表達(dá)
　　1.3比色法檢測VD模型大鼠海馬組織CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性MDA的

15、含量
　　1.4 Elisa檢測VD模型大鼠海馬組織IL-1、TNF-α蛋白表達(dá)
　　1.5免疫組化法檢測VD模型大鼠海馬組織iba-1、GFAP、Neun
　　2結(jié)果:
　　2.1Nrf2、HO-1、caspase3蛋白
　　與空白組相比，假手術(shù)組Nrf2、HO-1、caspase3的蛋白表達(dá)輕度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);與假手術(shù)組相比，模型組Nrf2、HO-1、caspase

16、3的蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，多奈哌齊組HO-1蛋白表達(dá)輕度升高、caspase3的蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組相比，參麻益智方中藥中、高劑量組Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)升高、caspase3的蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.2 Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA
　　與空白組相比，假手術(shù)組Nrf2mRNA、HO-1

17、 mRNA表達(dá)的改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組的Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01);與模型組相比，多奈哌齊組Nrf2 mRNA、HO-1mRNA的表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，參麻益智方中藥高、中劑量組Nrf2 mRNA、參麻益智方中藥高劑量組HO-1 mRNA的表達(dá)改變差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.3 CAT、

18、GSH、GSH-PX、SOD的活性、MDA的含量
　　與空白組相比，假手術(shù)組的CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性、MDA的含量改變，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組的CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性減弱，MDA的含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，多奈哌齊組GSH、GSH-PX、SOD的活性增強(qiáng)，MDA的含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，CAT的活

19、性改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，參麻益智方中、高劑量組CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性增強(qiáng)，MDA的含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.4 IL-1、TNF-α蛋白
　　與空白組相比，假手術(shù)組IL-1、TNF-α的蛋白含量改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組IL-1、TNF-α的蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相

20、比，多奈哌齊組IL-1的蛋白含量改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，TNF-α含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組相比，參麻益智方高劑量組可顯著降低IL-1、TNF-α蛋白的含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.5小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的免疫組化結(jié)果
　　100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞，空白組、假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小，有細(xì)長的突起，數(shù)量較少，模型組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體

21、變圓，分支減少，數(shù)量明顯增多，多奈哌齊組與參麻益智方中藥高、中劑量組小膠質(zhì)細(xì)胞較模型組數(shù)量減少，突起較長，胞體變小。
　　100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，空白組、假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較大呈圓形或橢圓形，有突起較多，數(shù)量較少，模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，突起變粗，數(shù)量增多。多奈哌齊組與參麻益智方中藥高、中劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞較模型組數(shù)量減少，突起變細(xì)，胞體變小。
　　100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，空

22、白組、假手術(shù)組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙小，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量較多;模型組和參麻益智方低劑量組細(xì)胞排列較假手術(shù)組紊亂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量減少;與模型組相比，多奈哌齊組、參麻益智方高、中劑量組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙變小，細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則。
　　3結(jié)論:
　　參麻益智方可提高VD模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)，提高CAT、GSH、GSH-PX、SOD的抗氧化活性，降低IL-1、TNF-α表達(dá)，降

23、低海馬組織MDA含量，降低caspase3的蛋白表達(dá)。具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用，從而保護(hù)海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。
　　參麻益智方可減少VD模型大鼠海馬組織iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞、GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。
　　參麻益智方可減輕VD模型大鼠海馬組織神經(jīng)元的損傷。
　　實(shí)驗(yàn)四參麻益智方對VD模型大鼠海馬組織NVU物質(zhì)信息交換的影響
　　方法:
　　Western b

24、lot法檢測VD模型大鼠海馬組織CX43、AQP4蛋白表達(dá)
　　結(jié)果:
　　與空白組相比，假手術(shù)組的CX43蛋白表達(dá)稍增加(P＜0.01)，AQP4表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)組相比，模型組的CX43、AQP4的蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，參麻益智方高、中劑量組可降低CX43、AQP4的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　參麻益智方