線粒體功能障礙對豚鼠耳蝸AQP-1表達和運輸?shù)挠绊?pdf

1、目的：建立一個線粒體功能障礙誘導(dǎo)的突發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾(Sudden onset sensorineural hearing loss，SSNHL)的動物模型，并且研究其對水通道-1(aquaporin-1，AQP-1)的表達與運輸?shù)挠绊憽?方法：62只白色雄性豚鼠分成2批，第一批49只用于建立SSNHL動物模型，第二批13只用于測試ATP缺乏對AQP-1表達與運輸?shù)挠绊?。?-硝基丙酸(3-nitropropionic aci

2、d，3-NP)耳蝸局部投放誘導(dǎo)線粒體功能障礙。第一批豚鼠根據(jù)給藥濃度和測試聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem responses，ABR)閾值的時間分為7組，即高劑量(0.5 mol/L 3-NP)組6小時組，高劑量1天組，高劑量3天組，低劑量組(0.3 mol/L 3-NP)1天組，低劑量3天組和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)對照組4小時組和1天組。第二批豚鼠分成3組，即0.

3、5mol/L 3-NP4小時組，3天組和PBS對照組。在手術(shù)顯微鏡下耳后入路暴露聽泡，找到圓窗龕，用浸有0.5 mol/L，0.3 mol/L 3-NP或PBS的明膠海綿分別放置于豚鼠左耳圓窗龕作用30分鐘后取出。破壞對側(cè)耳蝸，在各組動物規(guī)定的時間點測定ABR，于手術(shù)后2小時動物清醒后觀測前庭失衡癥狀用數(shù)碼攝像機記錄動物桶狀翻滾和自發(fā)性眼震。在全麻狀態(tài)下，第一批動物用4％多聚甲醛加1％戊二醛行活體心臟灌注固定，第二批動物用4％多聚甲醛行

4、活體心臟灌注固定。用同樣的固定液過夜后，上述標(biāo)本經(jīng)10％乙二胺四乙酸二鈉(disodium ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-2Na，)室溫下脫鈣3周。第一批動物耳蝸行JB4包埋、切片、甲苯胺蘭染色后用光鏡觀察各組形態(tài)學(xué)差異。第二批動物耳蝸石蠟包埋、切片后用免疫螢光染色，激光共聚焦顯微鏡(confocal microscope)觀察AQP-1表達與亞細胞分布，用image J測量耳蝸各圈側(cè)壁纖維細

5、胞AQP-1熒光的平均灰度值。 結(jié)果：第一批動物給藥后動物聽力喪失比率為：高劑量4小時組100％(5/5)，高劑量1天組91％(10/11)，高劑量3天組55％(6/11)，高劑量7天組20％(1/5)，低劑量1天組80％(4/5)，PBS對照組沒有變化(0/10)，低劑量組、高劑量4小時組、高劑量1天組、高劑量3天組、高劑量7天組，低劑量組和對照組(4小時組和1天組)給藥前后聽力變化的差別有顯著性(p<0.01)。給藥后前庭癥

6、狀發(fā)生率：高劑量組快相指向健側(cè)的自發(fā)性眼震發(fā)生率為100％，低劑量組快相指向健側(cè)的自發(fā)性眼震發(fā)生率為20％(1/5)。高劑量組的動物出現(xiàn)包括指向術(shù)側(cè)的桶狀翻滾在內(nèi)的嚴(yán)重步態(tài)障礙的發(fā)生率為68％(23/34)和低劑量組動物的嚴(yán)重步態(tài)障礙的發(fā)生率為20％(1/5)。僅有頭部傾斜癥狀的輕度步態(tài)障礙動物在高劑量組為32％(11/34)，低劑量組為20％(1/5)。上述前庭癥狀均在2天內(nèi)消失。高劑量組(6小時，1天，3天和7天)，低劑量組(1天和

7、3天)和對照組(4小時和1天)前庭癥狀發(fā)生率有差別。形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)：第一批所有PBS對照組和3～NP實驗組的動物均無內(nèi)淋巴積水。高劑量3天組Corti器，Claudius細胞，內(nèi)溝細胞明顯水腫；7天后上述水腫消退。高劑量組動物在給藥12小時內(nèi)螺旋神經(jīng)節(jié)細胞胞核和胞漿中有空泡形成，并且髓鞘和胞體間的間隙增大；7天后，上述空泡消失，髓鞘和胞體的間隙仍然存在，胞體萎縮，細胞染色較深，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞已開始變性。第二批動物confocal顯示，螺旋韌