循環(huán)血microRNA作為血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物的研究.pdf

1、研究背景:血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)等眾多心血管疾病的起始過程和共同通路，多種危險因素通過對內(nèi)皮的損傷而啟動或加重了AS等的病理過程并貫穿始終。因此，在血管內(nèi)皮損傷時做到早期診斷并及時干預(yù)，對于預(yù)防或延緩心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。MicroRNA（miRNA）是一類約由19～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達或促進靶基因mRNA降解發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近期發(fā)

2、現(xiàn)，循環(huán)血中某些miRNA的水平可作為心血管系統(tǒng)多種疾病診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。
　　 研究目的:確定內(nèi)皮細胞損傷后循環(huán)血中miRNA的水平，尋找可作為內(nèi)皮損傷診斷標(biāo)志物的循環(huán)血miRNA。
　　 研究方法:利用miRNA芯片檢測血管內(nèi)皮細胞miRNA的表達譜，根據(jù)正常人血漿miRNA的含量，確定候選miRNA。分別取20只12周齡、體重相近的雄性SD大鼠，通過高脂飲食聯(lián)合腹腔內(nèi)注射維生素D3注射液構(gòu)建大鼠高血脂模型;通過腹

3、腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)溶液構(gòu)建大鼠高血糖模型，同時取5只大鼠予以標(biāo)準(zhǔn)飲食同時腹腔內(nèi)注射等體積的生理鹽水（高血脂模型）或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（高血糖模型）分別作為模型的對照組，定期測量體重。在建模的不同時間定期股靜脈采集血標(biāo)本（高血脂模型10天取血一次;高血糖模型5天取血一次）。利用Elisa反應(yīng)測定血漿中總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglycerides，TG)、

4、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein，HDL)的含量驗證高血脂大鼠模型的建立;剪尾測血糖驗證大鼠高血糖模型的建立。建模不成功的大鼠不被納入本實驗。利用蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)檢測血管內(nèi)皮細胞形態(tài)變化;油紅O染色檢測血管內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積;Elisa方法檢測血漿可溶性細胞間粘附分子(Soubl

5、e intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1)的含量變化鑒定血管內(nèi)皮損傷的程度。定量PCR的方法檢測血漿中候選miRNA的含量變化。
　　 實驗結(jié)果:(1)通過miRNA芯片檢測人血管內(nèi)皮細胞miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)27種miRNA在血管內(nèi)皮細胞中高表達，結(jié)合正常人血漿中這些miRNA的含量，我們選擇其中的11種miRNA(miR-21、miR-126、let-7a、miR-222、mi

6、R-23a、miR-221、miR-125b、miR-26a、miR-29a、miR-16和miR-100)作為本實驗所要檢測的目標(biāo)miRNA。(2)高血脂大鼠建模存活率為70％，在腹腔內(nèi)注射維生素D3聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)后10天時，血脂水平較建模前及對照組明顯升高(TC:4.00±0.64 mmol/L vs1.81±0.53mmol/L; LDL:2.72±0.13 mmol/L vs0.63±0.32 mmol/L)，HE染色結(jié)果顯示

7、內(nèi)皮細胞形態(tài)無明顯變化，油紅O染色顯示內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積;20天時血脂水平保持較高水平（TC:2.65±0.21 mmol/L，LDL:1.17±0.38 mmol/L），HE染色顯示內(nèi)皮細胞形態(tài)無明顯變化，油紅O染色顯示內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積;喂養(yǎng)30天時，血脂水平持續(xù)較高水平(TC:2.80±0.32 mmol/L; LDL:1.71±0.45 mmol/L)，主動脈HE染色可見內(nèi)膜增厚，油紅O染色顯示內(nèi)皮下有微量脂質(zhì)沉積。此時，Elisa

8、檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)sICAM-1水平明顯高于對照組（2628.78±188.35 pg/mL vs1352.43±101.52 pg/mL），定量PCR結(jié)果顯示血漿中miR-126、let-7a、miR-21和miR-26a的水平明顯升高，miR-29a的水平明顯降低，miR-125b、miR-23a、miR-221、miR-222、miR-100和miR-16的水平無明顯變化，其中miR-26a的變化最為顯著，較建模前升高了5倍多。(3)高

9、血糖大鼠模型的建模成功率為80％，腹腔內(nèi)注射STZ溶液后5天血糖較建模前及對照組明顯升高（24.61±6.96 mmol/L vs7.91±0.37 mmol/L），10天后血糖保持較高水平（25.68±4.78 mmol/L），HE染色結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞形態(tài)無明顯變化;15天后血糖穩(wěn)定在較高水平（26.28±6.34mmol/L），HE染色結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細胞無明顯變化;20天后血糖仍在較高水平(29.01±4.24 mmol/L)，H

10、E染色結(jié)果顯示血管內(nèi)膜增厚、結(jié)構(gòu)紊亂。此時，Elisa檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)sICAM-1水平明顯高于對照組(4643±1013 pg/mLvs2120.56±645.77 pg/mL)，定量PCR結(jié)果顯示，建模后20天血漿中miR-126、miR-21和miR-221的水平出現(xiàn)了明顯的升高，miR-16和miR-23a的水平明顯降低，miR-125b、miR-29a、miR-222、miR-100、let-7a和miR-26a的水平無明顯變化。