腺苷A1受體介導(dǎo)的PI通路在酒精性肝纖維化大鼠星狀細(xì)胞模型中的作用.pdf

1、酒精性肝病是一種由于長(zhǎng)期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟類疾病。其疾病譜較廣，從脂肪肝到肝硬化甚至肝癌，而酒精性肝纖維化是這個(gè)過(guò)程中重要的一環(huán)。如何預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)酒精性肝纖維化的發(fā)生已愈來(lái)愈受到關(guān)注。在酒精性肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，酒精在肝臟中的代謝物乙醛可激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，HSC的活化會(huì)刺激產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。因此，HSC的活化增殖是酒精性肝纖維化發(fā)生的

2、中心環(huán)節(jié)。
　　隨著對(duì)腺苷及其受體研究的逐步深入，人們認(rèn)識(shí)到腺苷受體(adenosine receptor，AR)在肝臟疾病中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究表明咖啡因作為非選擇性AR拮抗劑不僅能顯著抑制大鼠酒精性肝纖維化模型中肝纖維化的發(fā)生，同時(shí)內(nèi)外研究表明還能顯著抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC活化。前期研究還顯示A1R和A2AR拮抗劑均可抑制酒精性肝纖維化中HSC的活化增殖但二者對(duì)cAMP-PKA-CREB通路有相反的調(diào)節(jié)作用，其中A2

3、AR所介導(dǎo)的cAMP-PKA-CREB通路作用占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。
　　目前認(rèn)為，在酒精依賴形成過(guò)程中，由G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的cAMP信號(hào)通路和磷脂酰肌醇（PI）信號(hào)通路是介導(dǎo)酒精效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)主要靶點(diǎn)，其中PI通路的關(guān)鍵信號(hào)分子DAG和PKC也均是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)。所以，我們推測(cè)腺苷A1受體在酒精性肝纖維化中可能通過(guò)介導(dǎo)PI通路來(lái)調(diào)控HSC的活化增殖且與cAMP信號(hào)通路有信號(hào)交聯(lián)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究采用乙醛刺激HSC-

4、T6細(xì)胞建立酒精性肝纖維化HSC模型，在此基礎(chǔ)上觀察腺苷A1受體介導(dǎo)的PI通路在調(diào)控HSC活化增殖中的作用以及與cAMP-PKA信號(hào)通路的交聯(lián)作用。
　　研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)部分：
　　1. A1R在酒精性肝纖維化細(xì)胞模型中表達(dá)增加
　　我們首先通過(guò)乙醛(200μM)刺激HSC-T648h建立酒精性肝纖維化模型，檢測(cè)其A1R的表達(dá)。Real Time PCR及Western blot結(jié)果顯示：正常組及肝纖維化模型組

5、中均有A1R表達(dá)且模型組中A1R mRNA和蛋白水平顯著高于正常組。
　　2. siRNA沉默A1R對(duì)HSC活化增殖的影響
　　實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、A1R siRNA組和陰性對(duì)照組。根據(jù)A1R基因序列設(shè)計(jì)并合成siRNA，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進(jìn)HSC中。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組HSC活力顯著下降，表明沉默A1R可顯著抑制已活化的HSC活力。進(jìn)一步采用Real Time PCR檢測(cè)α-SMA和Collagen I mRNA的表達(dá)，We

6、stern blot法檢測(cè)α-SMA和Collagen I蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，而陰性對(duì)照組表達(dá)無(wú)顯著差異，這表明靶向封閉A1R基因的表達(dá)可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖。
　　3. AR介導(dǎo)的PI信號(hào)通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC中的作用
　　實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、UTP組(IP3的前體物質(zhì)，介導(dǎo)Ca2+釋放)、非選擇性AR激動(dòng)劑NECA組和U

7、TP+NECA組。除正常組外，其余各組用乙醛(200μM)作用24h以制備大鼠酒精性肝纖維化 HSC模型。UTP組給予 UTP(100μM)處理24h，NECA組給予 NECA(10μM)處理24小時(shí)，UTP+NECA組同時(shí)給予UTP(100μM)和NECA(10μM)處理24小時(shí)。采用ELISA法檢測(cè)各組HSC內(nèi)IP3的含量，Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PLC蛋白的表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組HSC胞內(nèi)Ca2+的表達(dá)。

8、結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組IP3含量、其信號(hào)中關(guān)鍵信號(hào)分子 PLC蛋白表達(dá)及胞內(nèi) Ca2+的表達(dá)明顯升高，同時(shí) UTP組與NECA組結(jié)果較模型組顯著升高，且UTP預(yù)處理顯著增強(qiáng)NECA的效應(yīng)。結(jié)果提示，在HSC存在PI信號(hào)通路。隨后進(jìn)一步用Real Time PCR檢測(cè)α-SMA和Collagen I mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)α-SMA和Collagen I蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UTP組、NECA組和UTP+N

9、ECA組α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，且UTP預(yù)處理顯著增強(qiáng)NECA的效應(yīng)。這表明AR介導(dǎo)的PI通路在HSC細(xì)胞的活化增殖中有調(diào)節(jié)作用。
　　4. A1R介導(dǎo)的PI通路在A1R拮抗劑抑制HSC活化增殖中的作用
　　在前期研究中已發(fā)現(xiàn)A1R拮抗劑抑制HSC活化增殖的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步闡明A1R介導(dǎo)的PI通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用，實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、A1R激動(dòng)劑CPA、A1

10、R拮抗劑DPCPX組和CPA+DPCPX組。除正常組外，其余各組用乙醛(200μM)作用24h以制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。CPA組給予 CPA(1μM)處理24h，DPCPX組給予 DPCPX(10nM)處理24h，CPA+DPCPX組同時(shí)給予CPA(1μM)和DPCPX(10nM)處理24小時(shí)。采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組HSC內(nèi)Ca2+的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)各組HSC內(nèi)IP3、DAG的含量，Western blot法檢測(cè)各

11、組HSC內(nèi)PLC、PKC蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)CPA處理后，模型組HSC中胞內(nèi)Ca2+的表達(dá)，IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表達(dá)上升。而DPCPX作用后HSC中胞內(nèi)Ca2+的表達(dá)，IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表達(dá)下降。同時(shí)，與單獨(dú)用藥組比較，CPA+DPCPX聯(lián)合用藥組上述作用均可逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明A1R調(diào)控的PI通路在乙醛誘導(dǎo)的HSC活化增殖中具有一定作用。
　　5. PLC-PKC信號(hào)通路與cAMP-PKA信號(hào)

12、通路的信號(hào)交聯(lián)
　　實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、PKC激動(dòng)劑PMA組、PKC抑制劑SC-3088組共同孵育大鼠HSC，比較不同組別HSC活化增殖情況，采用Elisa法檢測(cè)各組HSC內(nèi)cAMP的含量，Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PKA蛋白的表達(dá)?？疾霵KC活性的升高或降低對(duì)cAMP含量和PKA活性的影響。結(jié)果顯示PMA組α-SMA、Collagen I的表達(dá)、cAMP的含量和PKA蛋白的表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)，而經(jīng)SC-30

13、88處理后顯著下降。再將實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、PKA激動(dòng)劑FSK組、PKA抑制劑H89組共同孵育大鼠HSC，比較不同組別HSC活化增殖情況，Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PLC、PKC蛋白的表達(dá)?？疾霵KA活性的升高或降低對(duì)PLC、PKC活性的影響。結(jié)果顯示FSK組α-SMA、Collagen I的表達(dá)、PLC、PKC蛋白的表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)，而經(jīng)H89處理后顯著下降。闡明PLC-PKC信號(hào)通路與cAMP-PKA信號(hào)通路