P190蛋白在維系血腦屏障結(jié)構(gòu)中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的屏障之一，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)獨(dú)特內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)。血腦屏障由腦內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等組成，能夠維持腦內(nèi)離子、激素和遞質(zhì)等的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)一些能透過(guò)周圍血管的物質(zhì)具有屏障作用從而保護(hù)腦組織，對(duì)維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性起著重要作用。其中，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接和粘附連接是維持血腦屏障功能的核心結(jié)構(gòu)，血管內(nèi)皮細(xì)胞

2、間緊密連接的完整性對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞極性及調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性發(fā)揮著重要的作用。血腦屏障功能的變化和緊密連接的開放與閉合有關(guān)，而緊密連接開放與否與相關(guān)蛋白表達(dá)關(guān)系密切。
　　P190蛋白是一種神經(jīng)元跨膜蛋白，由1384個(gè)氨基酸組成，屬于單次跨膜蛋白，其N端在胞外，C端位于胞內(nèi)。最初發(fā)現(xiàn)于有髓神經(jīng)纖維郎飛氏節(jié)的節(jié)旁區(qū)軸突細(xì)胞膜上，主要在脊椎動(dòng)物腦內(nèi)表達(dá)，另外在卵巢、胰臟、腸、肺、心臟及睪丸等組織內(nèi)也有少量表達(dá)。目前研究表明，軸突細(xì)胞膜上的

3、P190、contactin與少突膠質(zhì)細(xì)胞膜上的蛋白neurofascin155(NF155)在節(jié)旁區(qū)相互結(jié)合，形成間隔樣連接，從而將郎飛氏節(jié)區(qū)的離子環(huán)境與髓鞘內(nèi)軸突周圍的離子環(huán)境分隔開來(lái)，保證神經(jīng)沖動(dòng)的跳躍式傳導(dǎo)。P190蛋白表達(dá)異?？僧a(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，P190-/-型小鼠的神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)速度明顯低于正常小鼠，而且在出生后不久即因神經(jīng)元變性壞死而導(dǎo)致死亡。另外有研究顯示多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)

4、患者腦內(nèi)P190表達(dá)水平明顯降低。P190表達(dá)降低可進(jìn)一步導(dǎo)致髓鞘脫離軸突，促進(jìn)軸突變性壞死，進(jìn)而形成神經(jīng)元變性損傷的惡性循環(huán)。在糖尿病性神經(jīng)病變的大鼠中，P190的表達(dá)水平也明顯降低。由此可見，P190蛋白的功能是至關(guān)重要的，但其具體功能和作用機(jī)制還不清楚。
　　我室研究人員發(fā)現(xiàn)P190蛋白除了在神經(jīng)軸突有表達(dá)外，在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)內(nèi)也有大量表達(dá)，而且表達(dá)的P190蛋白在細(xì)胞間連接處有聚集的傾向?；诖?，本研究以

5、P190蛋白胞內(nèi)段缺失突變細(xì)胞株作為基礎(chǔ)，進(jìn)一步檢測(cè)P190胞內(nèi)段缺失突變對(duì)HBMEC功能的影響;同時(shí)利用酵母雙雜交的方法，篩選與P190蛋白的胞內(nèi)段互作的蛋白，期望找出P190對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能作用的機(jī)制。
　　方法：
　　一、P190在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其與內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的關(guān)系
　　1、激光共聚焦觀察P190在小鼠不同組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中的分布。
　　2、Western blot和激光共聚焦檢測(cè)P190

6、在體外分離腦血管中的表達(dá)和分布。
　　3、利用HRP通透性試驗(yàn)，檢測(cè)P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變對(duì)HBMEC細(xì)胞單層通透性的影響。
　　4、懸滴聚集試驗(yàn)檢測(cè)P190不同結(jié)構(gòu)域缺失突變及P190胞外段抗體封閉后對(duì)HBMEC的細(xì)胞間黏附力的影響。
　　5、利用western blot方法檢測(cè)P190胞內(nèi)段缺失突變對(duì)HBMEC的緊密連接相關(guān)蛋白和粘附連接蛋白的表達(dá)的影響。
　　6、利用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)P190胞內(nèi)段缺

7、失突變對(duì)HBMEC的緊密連接相關(guān)蛋白和粘附連接蛋白分布的影響。
　　二、P190胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域互作蛋白的篩選和鑒定
　　1、利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選人胎腦文庫(kù)中與P190胞內(nèi)段互作的蛋白，并在酵母中共轉(zhuǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2、構(gòu)建PLCD3全長(zhǎng)及不同截短和P190胞內(nèi)段的重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　3、共轉(zhuǎn)PLCD3全長(zhǎng)及不同截短和P190胞內(nèi)段的重組表達(dá)質(zhì)粒至293T細(xì)胞中，應(yīng)用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證P190胞內(nèi)段與PLCD3相

8、互作用，并尋找PLCD3中與P190相互作用的結(jié)構(gòu)域。
　　4、在HBMEC中驗(yàn)證P190與PLCD3相互作用。
　　(1)純化GST-P190胞內(nèi)段融合蛋白，利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P190胞內(nèi)段與PLCD3相互作用。
　　(2)利用免疫共沉淀方法驗(yàn)證P190與PLCD3相互作用。
　　5、Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PLCD3在HBMEC中的表達(dá)和分布
　　6、構(gòu)建干擾HBM

9、EC中PLCD3表達(dá)的shRNA，獲得穩(wěn)定干擾PLCD3的細(xì)胞株。
　　7、利用HRP通透性試驗(yàn)，檢測(cè)PLCD3 knock down對(duì)HBMEC細(xì)胞單層通透性的影響。
　　8、利用western blot方法檢測(cè)PLCD3 knock down對(duì)HBMEC的緊密連接相關(guān)蛋白和粘附連接相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。
　　三、P190與PLCD3相互作用引起HBMEC通透性改變的機(jī)制研究
　　1、利用[3H]-inosit

10、ol標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)培養(yǎng)的P190胞內(nèi)段缺失細(xì)胞中PLC活化情況。
　　2、構(gòu)建PLCD3不同活性的重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　3、免疫熒光觀察P190胞內(nèi)段缺失細(xì)胞和PLCD3 knock down的細(xì)胞中F-actin的變化情況。
　　結(jié)果：
　　一、P190在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其與內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的關(guān)系
　　1、激光共聚焦結(jié)果顯示P190在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)。
　　2、Western

11、 blot和激光共聚焦結(jié)果顯示P190在體外分離的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
　　3、成功獲得P190胞內(nèi)段不同結(jié)構(gòu)域缺失的細(xì)胞株。
　　4、HRP通透性實(shí)驗(yàn)表明，P190胞內(nèi)段缺失內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HRP的通透性明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而SH3或band4.1結(jié)構(gòu)域分別缺失的內(nèi)皮細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，通透性則無(wú)明顯變化。
　　5、P190胞內(nèi)段缺失突變破壞細(xì)胞連接相關(guān)蛋白
　　(1) Western bl

12、ot結(jié)果顯示P190胞內(nèi)段缺失不影響粘附連接相關(guān)蛋白VE-cadherin的表達(dá)，但免疫熒光結(jié)果顯示P190胞內(nèi)段缺失破壞了VE-cadherin在細(xì)胞連接處的分布。
　　(2)懸滴聚集實(shí)驗(yàn)表明，P190胞內(nèi)端缺失突變內(nèi)皮細(xì)胞間粘附力明顯降低，而用P190胞外段抗體封閉后內(nèi)皮細(xì)胞間粘附力無(wú)明顯改變。
　　(3)Western blot結(jié)果顯示，細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、claudin5和claudin3表達(dá)水平無(wú)明顯改變

13、，而occludin表達(dá)則明顯下降。利用免疫熒光技術(shù)觀察到ZO-1和occludin在P190胞內(nèi)段缺失細(xì)胞連接處分布發(fā)生改變。
　　二、P190胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域互作蛋白的篩選和鑒定
　　1、酵母雙雜交法篩選得到75個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)DNA測(cè)序和NCBI BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了九種序列。根據(jù)文獻(xiàn)資料選擇PLCD3進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。
　　2、在酵母中驗(yàn)證P190胞內(nèi)段與PLCD3相互作用。
　　3、成功構(gòu)建PLCD3全長(zhǎng)及

14、不同截短和P190胞內(nèi)段的重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　4、共轉(zhuǎn)PLCD3全長(zhǎng)及不同截短和P190胞內(nèi)段的重組表達(dá)質(zhì)粒至293T細(xì)胞中，應(yīng)用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證P190胞內(nèi)段與PLCD3相互作用。結(jié)果顯示P190胞內(nèi)段可以與PLCD3相互作用，且與PLCD3-C2結(jié)構(gòu)域相互作用。
　　5、在HBMEC中驗(yàn)證P190與PLCD3相互作用。
　　(1)成功純化GST-P190胞內(nèi)段融合蛋白，利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P1

15、90胞內(nèi)段與PLCD3相互作用。結(jié)果顯示P190胞內(nèi)段可以與PLCD3相互作用。
　　(2)免疫共沉淀結(jié)果提示在HBMEC細(xì)胞中P190能與PLCD3相互作用
　　6、Western blot檢測(cè)PLCD3在HBMEC中的表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示PLCD3主要分布在HBMEC細(xì)胞膜和細(xì)胞核中。
　　7、構(gòu)建干擾HBMEC中PLCD3表達(dá)的shRNA，獲得穩(wěn)定干擾PLCD3的細(xì)胞株。
　　8、HRP通透性試驗(yàn)結(jié)果顯示

16、PLCD3 knock down后HBMEC細(xì)胞單層通透性較對(duì)照組相比明顯升高。
　　9、Western blot結(jié)果提示PLCD3 knock down后HBMEC的緊密連接相關(guān)蛋白和粘附連接蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　三、P190與PLCD3互作引起HBMEC通透性改變的機(jī)制研究
　　1、PLC活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)P190胞內(nèi)段缺失細(xì)胞株中PLC活性下降。
　　2、成功構(gòu)建PLCD3不同活性的重組表達(dá)質(zhì)粒。

17、>　　3、免疫熒光結(jié)果顯示在P190胞內(nèi)段缺失和PLCD3 knock down的細(xì)胞中F-actin重組，stress fiber形成減少。
　　結(jié)論：
　　HBMEC細(xì)胞中P190胞內(nèi)段(1305-1384aa)缺失后，可使內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性明顯提高，內(nèi)皮細(xì)胞間粘附力下降，F(xiàn)-actin發(fā)生重組，stress fiber形成減少，緊密連接相關(guān)蛋白和粘附連接相關(guān)蛋白的表達(dá)和發(fā)布發(fā)生改變，進(jìn)而破壞血腦屏障的完整性。利用酵母

18、雙雜交系統(tǒng)篩選出P190胞內(nèi)段的相互作用的新蛋白——PLCD3。通過(guò)免疫共沉淀和GST-pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)P190胞內(nèi)段可以與PLCD3相互作用，且與PLCD3-C2結(jié)構(gòu)相互作用。同時(shí)干擾PLCD3在HBMEC中的表達(dá)可使內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性升高，F(xiàn)-actin發(fā)生重組，stress fiber形成減少，與P190胞內(nèi)段缺失突變引起的現(xiàn)象一致。并且P190胞內(nèi)段缺失突變細(xì)胞株中PLC活性下降，推測(cè)P190通過(guò)與PLCD3相互作用影