染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達(dá)譜及手掌參醇提取物對(duì)其影響的研究.pdf

1、矽肺是由于長(zhǎng)期吸入大量含游離二氧化硅粉塵而引起的以肺間質(zhì)纖維化為主要病變的全身性疾病，在我國(guó)屬于法定職業(yè)病。199l～2002年我國(guó)職業(yè)病發(fā)病總數(shù)呈現(xiàn)明顯的凹形反彈趨勢(shì)。發(fā)病人數(shù)從20世紀(jì)90年代初的每年2.2萬(wàn)人逐步下降，1997年最低降至1萬(wàn)人后又呈反彈，2002年達(dá)1.5萬(wàn)人，其中主要是塵肺檢出率顯著回升，發(fā)病形勢(shì)依然嚴(yán)重。衛(wèi)生部公布的2006年全國(guó)共診斷各類職業(yè)病報(bào)告11519例，其中塵肺病8783例，占診斷職業(yè)病病例總數(shù)的76

2、.25％。2006年職業(yè)病報(bào)告具有以下特點(diǎn)：塵肺病例比例增加，發(fā)病時(shí)間縮短，發(fā)病年齡趨予年輕化，未成年工職業(yè)健康損害嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2006年全國(guó)累計(jì)報(bào)告職業(yè)病676,562例，其中：塵肺病累計(jì)發(fā)病616,442例，死亡146，195例，現(xiàn)患470,247例；近15年平均每年新發(fā)塵肺病人近1萬(wàn)例。據(jù)報(bào)道，塵肺病每年對(duì)國(guó)家造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約90億元人民幣，間接經(jīng)濟(jì)損失無(wú)法估計(jì)。而矽肺患者占了塵肺病例的近80％，表明矽肺是塵肺中危

3、害最嚴(yán)重的職業(yè)病。而且，停止粉塵暴露，塵肺病依然進(jìn)展；高濃度暴露，發(fā)病工齡縮短，發(fā)病年齡趨于年輕化，病情嚴(yán)重，死亡率高。并且，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量農(nóng)村務(wù)工人員參與無(wú)防護(hù)措施的接塵工作，接觸粉塵作業(yè)的人群還在急劇上升。ILO和WHO共同提出全球消除矽肺計(jì)劃，在2010年使矽肺的發(fā)病率顯著降低，到2030年完全消除矽肺。我國(guó)是塵肺大國(guó)，塵肺病人數(shù)、接觸粉塵作業(yè)人數(shù)都居世界首位。直至目前，矽肺的發(fā)病機(jī)理仍然不完全清楚，無(wú)早期診斷的特異性指標(biāo)。

4、一經(jīng)傳統(tǒng)的后前位胸大片確診，肺部病變已經(jīng)無(wú)法逆轉(zhuǎn)。而且也無(wú)特異性的治療藥物和方法，我國(guó)防治矽肺的藥物主要有克矽平、磷酸哇呱、輕基哇呱、檸檬酸鋁、矽肺寧、漢防己甲素以及某些中藥等，但大多有一定的毒副作用。因此，研究矽肺早期病理機(jī)制，及尋找一種安全有效、低毒的新型抗纖維化藥物，在矽肺病研究中已成為迫切需要解決的問(wèn)題。 研究目的： 為探討矽肺發(fā)生及中藥(手掌參)干預(yù)后的分子機(jī)制，以染矽塵大鼠為研究對(duì)象進(jìn)行肺組織基因表達(dá)譜的比較

5、分析，并初步對(duì)差異基因的功能進(jìn)行探討，以期從基因水平上揭示矽肺發(fā)生的分子機(jī)制，也為進(jìn)一步探索更加有效、低毒的防治藥物提供基礎(chǔ)。 研究方法： 1.動(dòng)物模型建立與處理 本研究設(shè)定四個(gè)組，分別為對(duì)照組、染矽塵組、手掌參組(模型治療組)和漢防己組(標(biāo)準(zhǔn)藥物治療組)。本研究采用SPF級(jí)近交群雄性Wistar大鼠，隨機(jī)將大鼠分為四組，每組40只。 染矽塵組與各治療組采用氣管暴露法，每只大鼠氣管內(nèi)注入濃度為5Omg/m

6、l的矽塵滅菌混懸液1ml，對(duì)照組注入0.9％NaCl注射液。染矽塵建模后第二天，手掌參組按手掌參提取物0.8/100g的量給予，每天灌胃；漢防己組按漢防己甲素液5mg/100g的量給予，隔天灌胃；對(duì)照組、染矽塵組給予蒸餾水2ml，每天灌胃，如此直到將動(dòng)物處死。以建模術(shù)時(shí)為0d記，模型建立后7d、14d、21d、28d和60d的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取8只大鼠處死，并將肺組織迅速投入液氮待用。 采用HE染色和天狼猩紅染色法，分別觀察矽肺結(jié)

7、節(jié)和Ⅰ、Ⅲ型膠原，并用Image-Pro Plus Version 4.5 for windowsTM圖像分析系統(tǒng)對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原進(jìn)行定量。 2.基因芯片檢測(cè)差異基因表達(dá)譜 應(yīng)用Illumina激光共聚焦光纖微珠基因芯片分析平臺(tái)，經(jīng)RNA擴(kuò)增和標(biāo)記、芯片雜交，并用BeadStation500激光共聚焦掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描；用BeadStudio分析軟件將掃描獲取的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，使用Illumina自行開(kāi)發(fā)的算法求

8、Diffscore值，比較一種基因探針在兩種組織中的表達(dá)差異程度。 采用DAVID生物信息學(xué)分析工具，采用Fisher精確概率檢驗(yàn)，對(duì)差異基因的基因功能和生物學(xué)通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)富集分析。并用realrime-PCR的方法對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。 研究結(jié)論: 本次芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲取了染矽塵早期的差異基因表達(dá)譜，從生物信息學(xué)角度群體分析了差異基因表達(dá)譜，將眾多與矽肺相關(guān)的基因分為若干功能相關(guān)的群體簇進(jìn)行研究，這些差異基因主要

9、涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)、熱休克蛋白等毒理相關(guān)基因；與DNA、RNA和蛋白代謝，及與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程相關(guān)基因；與氧化還原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶等分子功能相關(guān)基因；以及細(xì)胞因子、趨化因子及免疫反應(yīng)相關(guān)基因，由于篇幅所限，未對(duì)其--進(jìn)行討論。差異基因功能分類的結(jié)果提示染矽塵早期可能存在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而手掌參提取物成分復(fù)雜，活性并不單