奧曲肽對(duì)胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的效應(yīng).pdf

1、ZAC(zinc finger protein which regulates apoptosis and cell cycle arrest, ZAC)基因位于染色體6q24-25，此區(qū)域與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生有關(guān)，目前在大部分乳腺癌、卵巢癌、非功能性垂體腺瘤及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中均可檢測(cè)到ZAC基因表達(dá)缺失或表達(dá)下調(diào)。ZAC基因編碼誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡和調(diào)控細(xì)胞周期的鋅指蛋白，具有腫瘤生長(zhǎng)的作用，在乳腺癌和卵巢癌中經(jīng)常表達(dá)沉默。
　　

2、生長(zhǎng)抑素(somatostatin. SST)是一種調(diào)節(jié)肽。在人體內(nèi)生長(zhǎng)抑素以28肽和14肽兩種形式存在，分布較廣泛，作用機(jī)制也較復(fù)雜。體外細(xì)胞研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究證實(shí)，生長(zhǎng)抑素不僅可以抑制內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生激素，而且對(duì)胃腸道腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
　　 SST類似物奧曲肽(otreotide，OCT)可誘導(dǎo)垂體瘤細(xì)胞ZAC基因表達(dá)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。前期的研究表明，胃癌組織SST和ZAC基因的表達(dá)均明顯降低，且兩者的表達(dá)有正相關(guān)

3、性，提示兩者可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。ZAC是否參與了SST抑制胃癌細(xì)胞增殖通路?
　　 本研究分別克隆人白細(xì)胞、胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901的ZAC基因啟動(dòng)子，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體。轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901，經(jīng)過(guò)G418篩選，OCT孵育后，應(yīng)用Glomax熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性，分析OCT對(duì)胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的效應(yīng)，探討ZAC在SST抑制胃癌細(xì)胞增殖通路的作用。
　　 方法:
　

4、　 1．構(gòu)建ZAC基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體應(yīng)用PCR技術(shù)分別從人白細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901克隆ZAC基因啟動(dòng)子并插入T載體，分別命名為pGEM-T-Human-P、pGEM-T-BGC823-P和pGEM-T-SGC7901-P。經(jīng)NotI單酶切后，將啟動(dòng)子片段亞克隆至熒光素酶報(bào)告載體pGL4，構(gòu)建ZAC基因啟動(dòng)子報(bào)告載體，分別命名為pGL4-Human-P、pGL4-BGC823-P和pGL4-SGC7901-

5、P。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoI/HindⅢ雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定。
　　 2．轉(zhuǎn)染及篩選SGC7901細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pGL4；實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染pGL4-Human-P質(zhì)粒和pGL4-SGC7901-P；BGC823細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pGL4；實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染pGL4-Human-P和pGL4-BGC823-P。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，G418篩選。
　　 3．熒光素酶活性檢測(cè)加入10n

6、mol/L生長(zhǎng)抑素孵育24h，提取細(xì)胞上清，Glomax熒光檢測(cè)儀檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑素孵育前后熒光素酶活性。
　　 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間數(shù)值差異比較，以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1．構(gòu)建ZAC基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體pGL4-Human-P、pGL4-BGC823-P和pGL4-

7、SGC7901-P，經(jīng)XhoI/HindⅢ雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定，表明插入片段無(wú)誤。pGL4-Human-P、pGL4-BGC823-P和pGL4-SGC7901-P3個(gè)報(bào)告載體構(gòu)建成功。
　　 2．熒光素酶活性檢測(cè)SGC7901細(xì)胞：pGL4組、pGL4-Human-P組、pGL4-SGC7901-P組和熒光素酶活性分別為3635±51.3、32539±563.9和25134.5±37.3，實(shí)驗(yàn)組明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P＜0.

8、05)；OCT孵育后，分別為4728.5±43.6、97128.4±827.7和70812.6±69.6，實(shí)驗(yàn)組明顯增高(P＜0.05)。BGC823細(xì)胞：pGL4-Human-P組、pGL4-BGC823-P組和pGL4組熒光素酶活性分別為342.7±56.3、53998.6±753.9和5463.8±43.5，實(shí)驗(yàn)組明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P＜0.05)；OCT孵育后，分別為573±21.3、83206.5±289.6和9635±24.