石鰈遺傳多樣性及石鰈♂與牙鲆♀雜交子一代的遺傳學分析.pdf

1、本論文利用同工酶(Isozyme)電泳技術和內部簡單重復序列(ISSR)技術對石鰈群體遺傳多樣性進行了分析；對石鰈及其它四種鰈形目魚類養(yǎng)殖群體的遺傳結構進行了同工酶分析；采用PCR的方法對石鰈核糖體DNA(包括18S rDNA，ITSl，5.8S rDNA，ITS2，28S rDNA的D1-D3區(qū))及其假基因進行了克隆和分子進化分析；對石鰈及其它五種鰈形目魚類的ITS2和28S rDNA的D1-D3區(qū)進行了序列和分子系統(tǒng)學分析；對石鰈♂

2、與牙鲆♀雜交子一代進行了同工酶、ISSR和rDNA的遺傳學分析。主要結果如下： 1、采用水平淀粉凝膠電泳技術對石鰈14種同工酶在8種組織中的表達進行了分析，并在此基礎上對石鰈三個野生群體的遺傳多樣性進行了研究，共記錄了31個基因座位，14種同工酶的表達有明顯的組織特異性，SOD<'*>,GDH<'*>,G3PDH-2<'*>和ADH-2<'*>僅在肝臟中表達，SDH-1<'*>MDH-1<'*>和ADH-1<'*>僅在肌肉中表達

3、，LDH-B<'*>和LDH-C<'*>僅在眼睛中表達，MDH-2<'*>,GPI-3<'*>和SDH-2<'*>在8種組織中均有表達，其它基因座位的表達表現出不同的組織特異性。石鰈QD群體、WH群體和LZ群體的多態(tài)座位比例變化范圍為：25.00％-29.17％；觀察雜合度的變化范圍為：0.028-0.051；期望雜合度的變化范圍為：0.039-0.058；三個群體間的遺傳距離為：0.0004-0.0022，群體間的分化度Fst=0.0

4、164，表明群體間的遺傳分化較小，基因流較大N<,m>=14.98。 2、采用水平淀粉凝膠電泳技術對石鰈及其它四種鰈形目魚類養(yǎng)殖群體的遺傳結構進行了分析，結果表明，幾種鰈形目魚類養(yǎng)殖群體的多態(tài)座位比例的變化范圍為：0.0％(大菱鲆)-29.4％(牙鲆)；觀察雜合度(H<,o>)的變化范圍為：0.000(大菱鲆)-0.086(牙鲆)；期望雜合度(He)的變化范圍為：0.000(大菱鲆)-0.090(牙鲆)。與已有野生群體的研究結果

5、相比較，石鰈養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性尚未發(fā)生明顯變化；大菱鲆和漠斑牙鲆養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性發(fā)生了明顯降低；牙鲆養(yǎng)殖群體雖然群體雜合度沒有明顯變化，但發(fā)生了部分稀有等位基因的丟失；半滑舌鰨養(yǎng)殖群體的多態(tài)座位比例發(fā)生了一定程度的降低。 3、利用ISSR技術對石鰈3個野生群體和1個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行了分析，用篩選出的8個重復性好、多態(tài)性高的引物進行擴增分析.共得到183個擴增位點，片段大小在200-3000bp之間，四個群體多態(tài)位點

6、比例分別為：50.8％(QD群體)，49.7％(WH群體)，50.3％(LZ群體)，48.1％(YZ群體)，Shannon多樣性指數分別為18.28(QD群體)，18.46(WH群體)，18.53(LZ群體)，15.68(YZ群體)，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性低于野生群體。石鰈群體間的遺傳距離較小，表明石鰈群體間的遺傳分化較小，不同群體間的遺傳相似度較大。 4、采用PCR的方法對石鰈核糖體DNA(包括18S rDNA，ITSl，5.8

7、S rDNA，ITS2，28S rDNA的D1-D3區(qū))及其假基因進行了克隆和序列分析，并利用RT-PCR技術對rDNA的表達進行了分析，發(fā)現石鰈基因組內不僅存在較大的rDNA多態(tài)性，還存在大量的rDNA假基因序列。 石鰈基因組內存在三種主要類型的18S rDNA，18S rDNA類型Ⅰ的長度為1838bp；18S rDNA類型Ⅱ的長度為1823 bp，與類型Ⅰ相比有1個15bp的缺失，18SrDNA類型Ⅲ的長度為1816 bp

8、，與類型Ⅰ相比除了上述的15bp的缺失外，還有1個7bp的缺失；詳細的序列分析表明18S rDNA類型Ⅰ為石鰈預期的18S rDNA。采用PCR的方法對石鰈ITSl進行擴增得到片段大小不同的兩條帶(分別記為LFl和SFl)，對LFl和SFl進行克隆測序共獲得46條：ITSl序列，這些序列具有較高的序列多態(tài)性，可以分為五組(組Ⅰ，組Ⅱ，組Ⅲ，組Ⅳ和組Ⅴ)，組Ⅰ-Ⅱ的ITSl序列來自LFl，組Ⅲ-Ⅴ的ITSl序列來自SFl。組Ⅲ-Ⅴ的ITS

9、l序列長度(685-716 bp)比組Ⅰ-Ⅱ的ITSl序列長度(765-776 bp)短，但是組Ⅲ-Ⅴ的ITSl序列變異度(9.8％)比組Ⅰ-Ⅱ的ITSl序列變異度高(4.2％)。與LFl ITSl(組Ⅰ-Ⅱ)相連接的18S rDNA為18S rDNA類型Ⅰ；與SFl ITSl(組Ⅲ-Ⅴ)相連接的18S rDNA為18S：rDNA類型Ⅱ和類型Ⅲ。18S rDNA的表達分析表明，18S rDNA類型Ⅰ大量表達，沒有檢測到18S rDNA類

10、型Ⅱ和類型Ⅲ的表達。因此，18S rDNA類型Ⅰ為功能基因，18S rDNA類型Ⅱ和類型Ⅲ為假基因；與類型Ⅰ相連接的ITSl序列(組Ⅰ-Ⅱ)為石鰈工TSl的功能基因，與類型Ⅱ-Ⅲ相連接的ITSl序列(組Ⅲ-Ⅴ)為石鰈ITSl的假基因。 石鰈基因組內存在兩種主要類型的28S rDNA，28S rDNA的D1-D3區(qū)類型Ⅰ的長度為1480 bp；28S rDNA的D1-D3區(qū)類型Ⅱ的長度為1398 bp，與類型Ⅰ相比發(fā)生了多個位點缺

11、失；詳細的序列分析表明28S rDNA類型Ⅰ為石鰈預期的28S rDNA。采用PCR的方法對石鰈ITS2進行擴增得到片段大小不同的兩條帶(分別記為LF2和SF2)，對LF2和SF2進行克隆測序共獲得44條ITS2序列，這些序列具有較高的序列多態(tài)性，可以分為五組(組Ⅰ，組Ⅱ，組Ⅲ，組Ⅳ和組Ⅴ)，組Ⅰ-Ⅱ的ITS2序列來自LF2，組Ⅲ-Ⅴ的ITS2序列來自SF2。組Ⅲ-Ⅴ的：ITS2序列長度(448-454bp)比組Ⅰ-Ⅱ的ITS2序列長度

12、(518-528bp)短，但是組Ⅲ-Ⅴ的ITS2序列變異度(6．1％)比組Ⅰ-Ⅱ的ITS2序列變異度高(5．6％)。與LF2 ITS2(組Ⅰ-Ⅱ)相連接的28s rDNA為28S rDNA類型Ⅰ；與SF2 ITS2(組Ⅲ-Ⅴ)相連接的28S．rDNA的D1-D3區(qū)為28S rDNA類型Ⅱ。28S rDNA的表達分析表明，28S rDNA類型Ⅰ大量表達，沒有檢測到28S rDNA類型Ⅱ的表達。因此，28S rDNA類型Ⅰ為功能基因，28S

13、 rDNA類型Ⅱ為假基因，與類型Ⅰ相連接的ITS2序列(組Ⅰ-Ⅱ)為石鰈ITS2的功能基因，與類型Ⅱ相連接的ITS2序列(組Ⅲ-Ⅴ)為石鰈ITS2的假基因。 5、對石鰈及其它五種鰈形目魚類：ITS2和28S rDNA的D1-D3區(qū)進行了分子系統(tǒng)學分析，6種魚ITS2片斷從448 bp-570 bp不等，發(fā)生變異的位點達51-33％；28S rDNA的D1-D3區(qū)片斷長度從1398 bp-1480 bp不等，發(fā)生變異的位點僅為6．

14、84％，明顯低于ITS2的變異度，這驗證了核糖體DNA編碼區(qū)的進化速率明顯低于非編碼區(qū)。根據ITS2、28S rDNA的D1-D3區(qū)和ITS2+28S rDNA的D1-D3區(qū)構建的系統(tǒng)發(fā)生樹表明，石鰈種內的LF2和SF2首先聚在一起，然后與同屬鰈科的星鰈聚在一起；同屬于牙鲆科的牙鲆和漠斑牙鲆聚在一起；相比鲆科和舌鰨科，牙鲆科和鰈科的親緣關系更近些，這與傳統(tǒng)形態(tài)分類結果是一致的。 6、對石鰈♂與牙鲆♀雜交子一代進行了遺傳學分析，利

15、用水平淀粉凝膠電泳技術，對親本石鰈、牙鲆及其雜交子一代進行了同工酶比較分析，結果表明，親本各組織的同工酶在雜交子代中得到表達，雜種的同工酶譜又可分為三類：1)完全互補型，雜種子一代酶譜完全兼有兩個親本的所有酶帶，沒有新的酶帶產生。如本實驗中HK(己糖激酶)和PGM(磷酸葡萄糖變位酶)；2)互補親本的部分酶帶，同時丟失親本的部分酶帶。這種類型在本實驗中沒有發(fā)現；3)表現雙親未出現的酶帶，即除互補雙親酶帶外，出現了親本皆無的酶帶。如LDH(

16、乳酸脫氫酶)、IDHP(異檸檬酸脫氫酶)、SDH(山梨醇脫氫酶)和ADH(乙醇脫氫酶)，這四種酶在雜種子一代中均出現了非親本酶帶。 對ISSR標記在石鰈與牙鲆雜交家系的分離方式進行了研究，結果表明：8個ISSR引物共擴增出181個標記，其中116個為多態(tài)性，占總數的64.09％；標記在F1代呈三種分離方式：符合孟德爾分離比例、偏離孟德爾分離比例和異常分離。3種分離位點出現的頻率和數量分別為：82.87％、150，11.05％、2

17、0，6.08％、11。符合孟德爾分離比例的情況包括：1)不分離；2)親本中呈多態(tài)而在子代中1：1分離；3)親本均有而在子代中3：1分離。偏分離的標記包括：親本中呈多態(tài)而在子代中偏離1：1分離的標記和親本均有而在子代中偏離3：1分離的標記。異常分離的標記為在F1代出現雙親均不具備的標記，還有一種是雙親或單親有，而子代卻無擴增產物。該研究結果可為進一步利用該群體構建牙鲆和石鰈遺傳圖譜打下良好的工作基礎并提供一定的理論依據。 對雜交子