動(dòng)物源細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測(cè)試劑盒研制.pdf

1、本研究使用測(cè)序菌株作陽(yáng)性對(duì)照，藥敏質(zhì)控菌ATCC25922抽提的DNA作陰性對(duì)照，建立了動(dòng)物源細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測(cè)方法。同時(shí)，針對(duì)Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物等組份用量及退火溫度、循環(huán)次數(shù)等循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化并組裝試劑盒。優(yōu)化結(jié)果如下：10×PCRBuffer5μL，濃度為25mM/LMgCl23.0μL，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μL，濃度為2.5U/ULTaq

2、DNA聚合酶0.35μL，濃度掃為25mmol/L三種耐藥基因即tetA基因、tetC基因和tetM基因的特異性上下游引物(25mmol/L)分別1.0μL、0.3μL、0.4μL。將其置于一無(wú)菌的PCR反應(yīng)薄壁管中，加入已制備好的模板5μL，補(bǔ)水至總體積50μL后加入20μL礦物油封頂即可。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min;然后進(jìn)入循環(huán)：94℃變性60s、56℃退火60s、72℃延

3、伸60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min后，電泳觀察結(jié)果。 應(yīng)用本檢測(cè)試劑盒和傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法(K-B法)對(duì)100株細(xì)菌的耐藥基因型和表型同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并比較兩者檢測(cè)過(guò)程和檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，細(xì)菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高為：92％(92/100)，對(duì)多西環(huán)素的耐藥率次之，為：84％(84/100)，對(duì)米諾環(huán)素耐藥率相對(duì)最低，為：75％(75/100)。在100株待檢細(xì)菌中，tetA基因的檢出率為46％(46/100)，tet

4、C基因的檢出率為：38％(38/100)，tetM基因的檢出率為：33％(33/100)。兩種方法檢出結(jié)果的符合率為89％。比較常規(guī)的耐藥基因檢測(cè)方法：?jiǎn)沃豍CR方法與試劑盒采用的三重PCR方法，檢測(cè)結(jié)果符合率為100％。 在此基礎(chǔ)上，對(duì)試劑盒特異性、敏感性、重復(fù)性和保質(zhì)期等進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測(cè)試驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果表明：本試劑盒具有極強(qiáng)的特異性，只能特異性擴(kuò)增出目的耐藥基因。本試劑盒具有很高的靈敏度(4.0×104cfu/mL)；并且性能

5、穩(wěn)定，顯示出了很好的批內(nèi)和批間重復(fù)性(100％)。試劑盒在-20℃下的保質(zhì)期為6個(gè)月。 利用研制的試劑盒，對(duì)我國(guó)24個(gè)省的樣品進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)。結(jié)果顯示，不同種屬的動(dòng)物源細(xì)菌、不同來(lái)源動(dòng)物，不同年代大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥基因分布存在很大的差異。從70年代到今天，不同年代大腸桿菌tet基因的檢出率呈明顯上升的趨勢(shì)。 本研究率先在國(guó)內(nèi)外建立了動(dòng)物源細(xì)菌四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測(cè)試劑盒，并進(jìn)行了初步應(yīng)用，這在國(guó)內(nèi)外均