不同強度絕對不應期電刺激對心力衰竭兔心臟功能影響的實驗研究.pdf

1、心力衰竭(heart failure，HF)是導致死亡的重要危險因素，而且能增加病人住院治療日，降低生活質(zhì)量，提高治療費用。最近二十年，HF的藥物治療方面取得了重大進步，ACEI、β受體阻滯劑、醛固酮拮抗劑在降低HF病人的發(fā)病率和死亡率中有著重要的作用。這些治療延遲了難治性HF的進展，但是不足以阻止疾病的惡化進程，仍需進一步干預方法。最近幾年，機械裝置為基礎的治療方法出現(xiàn)，像心臟再同步治療、心臟輔助裝置、優(yōu)化系統(tǒng)(Impulse Dyn

2、amics)。心臟收縮調(diào)節(jié)(cardiac contractilitymodulation，CCM)作為機械裝置治療方法進入人們視線，它是在絕對不應期內(nèi)給予的非興奮性刺激(Non-Excitatory Currents，NEC)即絕對不應期電刺激（absolute refractory period electric stimulation，ARPES），是一種非常有前景的新治療方法，目前已應用于治療嚴重HF的Ⅲ期臨床病人。在H人中顯示

3、能提高人的提高運動耐量和生活質(zhì)量，最近研究顯示從心肌組織活檢中發(fā)現(xiàn)，CCM處理能使HF時許多異常基因表達正?；▍⑴c鈣循環(huán)的蛋白質(zhì)。心臟收縮性調(diào)節(jié)是非藥理學方法使用電流提高肌絲鈣效應，是提高HF心臟收縮功能安全的、可行的方法，有報道認為這種方法無致心律失常作用。
　　 HF是由于心肌疾病或者心臟外因素損害泵功能引起綜合征，表現(xiàn)為心臟功能障礙，盡管心腔充盈充分，心輸出量降低，不能滿足組織器官代謝需求，同時神經(jīng)介質(zhì)激活，在分子水

4、平心肌凋亡和心肌適應性改變。交感神經(jīng)系統(tǒng)(SAS)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在調(diào)節(jié)心肌收縮力、調(diào)節(jié)血管反應、維持血流灌注等方面發(fā)揮著重要作用。HF時，交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，兒茶酚胺類物質(zhì)如去甲腎上腺素等釋放入血，具有提高心率、正性肌力作用（增加心肌收縮的力量和速度），同時通過收縮組織、腎臟等內(nèi)臟和皮膚血管，增加了前負荷和后負荷。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，腎素活化，增加交感神經(jīng)張力同時，血管緊張素Ⅱ刺激醛固酮加壓素產(chǎn)生

5、，導致心肌纖維化和心室重構(gòu)。
　　 本研究通過檢測去甲腎上腺素(NE)、腎素(Renin)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)，觀察ARPES對SAS、RAAS的影響，探討其改善心臟功能的神經(jīng)內(nèi)分泌機制。
　　 B型利鈉肽(BNP)是診斷早期HF的重要指標，敏感性90％，特異性76％，其表達水平的高低與HF的NYHA心臟功能分級相關，而且有助于評估HF病人預后，判斷HF的治療是否需要加強。BNP水平升高是HF非常

6、重要的獨立預測因子，而且與腎功能無關，也是60天死亡的非常重要預測指標。在一項BNP研究中，1586名因呼吸困難急癥入院的病人，HF病人的BNP濃度最高，有非心源性呼吸困難但有心臟功能不全病史病人次之，沒有HF或左室功能不全的病人最低，對鑒別HF有重要的價值。
　　 慢性和亞臨床炎癥是HF的病理基礎，其主要特征就是全身性炎癥反應，因此HF并不僅僅是泵衰竭疾病，而是一種全身性疾病。全身炎癥反應表現(xiàn)在炎性因子產(chǎn)生、釋放，補體激活以及

7、自身抗體產(chǎn)生，其中細胞炎性因子在HF發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。細胞因子是免疫系統(tǒng)細胞通過神經(jīng)激素激活產(chǎn)生的，其中最重要的兩種是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6(IL-6)。TNF-α引起內(nèi)皮功能障礙，蛋白質(zhì)合成減少，分解增加，導致肌肉分解增加，心肌收縮力下降，同時誘導心肌細胞肥大。有研究表明NYHAⅣ級病人TNF-α、IL-6明顯升高，可直接影響心臟功能，導致嚴重運動能力受限。目前對IL-6通過刺激心肌糖蛋白受體130參與心室肥大

8、有了一定的認識。IL-6與NYHA分級、住院治療時間、左室功能降低相關，它作為預測標記物的作用至今仍沒有定論。
　　 縫隙連接（Gap junctions，Gj）形成了細胞與細胞電流精確有序的傳導通路，支配心臟節(jié)律，而其功能與心臟表達connexin43(CX43)、connexin(Cx40)、connexin(Cx45)等縫隙連接蛋白密切相關?？p隙連接蛋白連接異常主要表現(xiàn)在縫隙連接蛋白的分布異常和數(shù)量、表達類型改變，與HF的

9、病理生理學有著密切聯(lián)系?？p隙連接蛋白的表異常達和組織重構(gòu)在HF的作用已經(jīng)有報道。在心衰病人和動物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CX43表達降低，縫隙連接分布紊亂，這些特征性變化與心律失常、心臟功能不全相關。
　　 雷尼丁受體受體（ryanodine receptors，RyRs）本質(zhì)上是一種鈣離子通道。根據(jù)RyRs的分布和生物特性的不同，哺乳類動物RyRs可分為RyR1、RyR2、RyR3，其中RyR2主要在心肌細胞中表達。心肌收縮的強弱決定于R

10、yR2釋放Ca2+的多少。心肌細胞產(chǎn)生動作電位時，二氫吡啶受體（dihydropyridine receptor, DHPR）介導少量細胞外鈣內(nèi)流，RyR2被激活，細胞內(nèi)鈣庫的Ca2+釋放到細胞質(zhì)，引起胞質(zhì)中游離的Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白，啟動心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)。肌漿網(wǎng)RyR2調(diào)控的細胞內(nèi)Ca2+異常與HF、心律失常、心肌梗死等疾病密切相關。
　　 本研究通過評估ARPES的急性效應（左室壓力變化如dP/dt等血流動力

11、學參數(shù)、心臟功能、心室肌CX43、RyR2、血清BNP表達水平），了解ARPES對HF的影響。綜上所述，本實驗從SAS、RAAS、細胞炎性因子、心肌CX43和RyR2影響心臟功能的角度，探討不同強度ARPES影響心臟功能的機制。
　　 第一部分、不同強度絕對不應期電刺激對心力衰竭兔心臟功能的影響
　　 目的：觀察ARPES對HF兔心臟功能指標、血流動力學指標、血清BNP水平的影響，探討其是否對HF兔心臟功能具有保護作用。

12、
　　 方法：6月齡成年新西蘭大白兔，采用升主動脈縮窄法，1個月后建立兔HF模型。開胸術前、術后1個月、ARPES后即刻測量心臟功能及制備血清標本，術后1個月測量血流動力學指標。術中常規(guī)監(jiān)測肢體導聯(lián)心電圖(ECG)，ARPES持續(xù)12小時。運用彩色超聲心動圖儀對假手術組（SHAM組）、心力衰竭組(HF組)、絕對不應期電刺激組（ARPES組）三組兔進行圖像采集，二維超聲引導下取左室長軸切面，經(jīng)M超曲線測量舒張末期室間隔厚度(ⅣSd

13、)、舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分數(shù)(EF％)、左室短軸縮短率(FS％)、左心室的舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)，心尖五腔心切面測量主動脈瓣上流速(AV)，心尖四腔心切面觀察二尖瓣反流，測量舒張期二尖瓣口血流速度(MV)。頸動脈途徑法通過MPA2000心臟功能儀測量左室壓最大上升與下降速率(+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin)

14、、左室收縮峰壓(LVSP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)、左室平均壓力（LVPmean）、心率(HR)。采用雙抗體夾心ABC-ELWASA法檢測BNP表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況：術前SHAM、HF、ARPES三組間比較體重(W)、心率(HR)、呼吸頻率(R)無統(tǒng)計學意義。術后1個月時，HF組、ARPES組HR、R較SHAM顯著升高，P＜0.05，而體重有降低，但無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。ARPES組

15、、HF組間HR、R、W比較，無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。HF組、ARPES組HR、R較術前顯著升高，P＜0.05，W無明顯變化，P＞0.05。SHAM組HR、R、W較術前無差別，P＞0.05。
　　 2.生化指標的改變：術前三組間生化指標均無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。ARPES組、HF組肝功能指標（ALT、AST）和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH)較SHAM顯著升高，P＜0.05。ARPES組ALT、AST、CK、CK-MB

16、、LDH較HF組有降低，但無統(tǒng)計學意義。三組間比較ALT/AST均無統(tǒng)計學意義。腎功能指標血清（尿素、肌酐、K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+）三組間比較無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。HF組、ARPES組血脂(TG、TC)均較SHAM組顯著下降，P＜0.05，但VLDL及血糖三組間比較無統(tǒng)計學意義。HF組、ARPES組ALT、AST、CK、CK-MB、LDH較術前顯著升高，P＜0.05，血脂TG、TC顯著降低，P＜0.05，其他生化

17、指標較術前無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。SHAM組生化全項較術前均無差異，P＞0.05。
　　 3.絕對不應期電刺激對兔心臟彩超指標的影響：HF組LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV較SHAM組顯著升高，P＜0.01，EF、FS、MV顯著降低，P＜0.05，而LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。ARPES組LVEDD、EDV較HF組有降低，但無統(tǒng)計學意義，LVESD、ESV顯著降低，P＜0.01，EF、FS、AV

18、、MV顯著升高，P＜0.01，但LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。ARPES組LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV較SHAM組顯著升高，P＜0.05，EF、FS、MV顯著降低，P＜0.01，但LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。不同刺激強度（ARPES-L亞組、ARPES-H亞組）對心臟彩超各參數(shù)的影響無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。HF組、ARPES組LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV較術前顯著升高

19、，P＜0.01，EF、FS、MV顯著降低，P＜0.05，而LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。SHAM組心臟彩超各參數(shù)較術前無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。
　　 相關分析：對心臟射血分數(shù)LVEF和LVEDD、LVESD做相關分析表明EF和LVEDD、LVESD(r=-0.6099，-0.8694)呈負相關。
　　 4.絕對不應期電刺激對兔血流動力學的影響：ARPES組、HF組LVSP、LVEDP、LVPmean、

20、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin絕對值較SHAM組顯著降低，P＜0.01。ARPES組LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin絕對值較HF組顯著升高，P＜0.01。另外ARPES-H亞組LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin絕對值較ARPES-L亞組有升高，但無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。
　　 5.絕對不應期電刺激對兔血清BN

21、P表達水平的影響：術前三組間BNP表達水平比較無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。1個月時ARPES組、HF組BNP表達水平較SHAM組顯著升高，P＜0.01，ARPES組較HF組顯著降低。ARPES-H亞組BNP表達水平較ARPES-L亞組無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。ARPES組、HF組BNP表達水平較術前顯著升高，P＜0.01，SHAM組較術前無統(tǒng)計學意義P＞0.05。
　　 結(jié)論：通過升主動脈縮窄法可成功建立兔HF模型，短期ARP

22、ES可增強HF兔心肌收縮力，穩(wěn)定血流動力學，改善心臟功能。實驗提示ARPES增可強心肌收縮力，降低LVESD，從而改善心臟功能，但不同ARPES刺激強度對HF兔心肌收縮力、改善心臟功能和血流動力學的影響無差別。
　　 第二部分、不同強度絕對不應期電刺激對心力衰竭兔交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用
　　 目的：通過ARPES后NE表達水平，了解其對SAS的影響。通過觀測Renin、AngⅡ、ALD的表達水平

23、，探討ARPES對RAAS的作用。同時觀察低強度、高強度ARPES（ARPES-L、ARPES-H）對SAS、RAAS的影響是否存在差異。
　　 方法：SHAM組、HF組開胸術前、術后1個月，ARPES組開胸術前、ARPES后頸內(nèi)靜脈采血，制備血清標本，采用雙抗體夾心ABC-ELWASA法檢測NE、Renin、AngⅡ、ALD的濃度，觀察SAS和RAAS的關系。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況及生化指標的改變：

24、同第一部分。
　　 2.開胸術前SHAM組、HF組、ARPES組NE、Renin、AngⅡ、ALD無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。術后SHAM組、HF組NE、Renin、AngⅡ、ALD較SHAM組顯著升高，P＜0.01，ARPES組NE、Renin、AngⅡ較HF組顯著升高，P＜0.01，但ALD無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。SHAM組、HF組NE、Renin、AngⅡ、ALD較術前顯著升高，P＜0.01，SHAM組較術前無統(tǒng)計學意

25、義。ARPES-L亞組NE、Renin、AngⅡ、ALD較ARPES-H亞組無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。
　　 3.NE與Renin、AngⅡ、ALD相關分析表明：血清Renin、AngⅡ、ALD含量與NE(0.8642，0.8329，0.6581，P＜0.01)呈正相關。另外，Renin與AngⅡ(0.8141,P＜0.01)、Renin與ALD(0.6911,P＜0.01)、AngⅡ與ALD(0.6895，P＜0.01)亦呈

26、正相關。
　　 結(jié)論：HF兔NE分泌增多，SAS激活，Renin、AngⅡ、ALD升高，RAAS系統(tǒng)亦激活，表明SAS、RAAS系統(tǒng)參與了HF的代償機制，同時參與了HF的發(fā)生和發(fā)展。ARPES可以啟動SAS、RAAS的代償機制，可能參與了HF的進展。不同強度ARPES對SAS、RAAS的影響不存在差別。
　　 第三部分、不同強度絕對不應期電刺激對心力衰竭兔細胞炎性因子腫瘤壞死因子α、白介素-6的作用
　　 目的：

27、觀察SHAM組、HF組、ARPES組兔血清細胞炎性因子TNF-α、IL-6的表達水平，了解ARPES對細胞炎性因子的作用，探討ARPES是否具有保護心臟的抗炎機制。同時對比不同強度ARPES對細胞因子作用的差異。
　　 方法：頸內(nèi)靜脈法留取血液，制備血清標本，留置血液時間點為SHAM組、HF組、ARPES組三組于術前，SHAM組、HF組開胸術后1個月，ARPES組刺激處理后即刻。采用雙抗體夾心ABC-ELWASA法檢測TNF-α

28、、IL-6表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.術前TNF-α、IL-6表達水平無統(tǒng)計學差異，P＞0.05，開胸術后1個月時HF組、ARPES組TNF-α、IL-6表達水平較SHAM組顯著升高，P＜0.01，ARPES組較HF組顯著降低，P＜0.01。HF組、ARPES組TNF-α、IL-6表達水平較術前顯著升高，P＜0.01，SHAM組較術前無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。ARPES-H亞組較ARPES-L亞組TNF-α、I

29、L-6表達水平有降低，但無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。
　　 2.相關分析：對兔血清細胞炎性因子TNF-α、IL-6表達水平做相關分析表明給予HF兔ARPES處理后TNF-α與IL-6表達水平(0.8582，P＜0.01)呈正相關。血清TNF-α表達水平與Renin、AngⅡ、ALD表達水平(r=0.8676，0.7691，0.6986，P＜0.01)，與NE表達水平(r=0.3402，P＞0.05)無相關關系。血清IL-6表達水

30、平與NE、Renin、AngⅡ、ALD表達水平(r=0.8004，0.8457，0.8208，0.7299，P＜0.01)呈正相關。
　　 結(jié)論：細胞炎性因子TNF-α、IL-6在HF時表達上調(diào)，與SAS、RAAS共同參與了HF的發(fā)生和發(fā)展。ARPES可抑制HF后細胞炎癥反應，但不同強度ARPES對HF兔的細胞炎性反應的作用無顯著差異。ARPES改善心臟功能的作用可能被SAS、RAAS激活而部分抵消。
　　 第四部分、不

31、同強度絕對不應期電刺激對心力衰竭兔心肌2型雷尼丁受體、縫隙連接蛋白43的影響
　　 目的：觀察SHAM組、HF組、ARPES組兔RyR2、CX43在心室肌表達水平變化，了解ARPES對心肌細胞興奮、收縮以及興奮收縮偶聯(lián)的影響，從分子水平探討非興奮性刺激的作用機制。
　　 方法：開胸術后1個月時SHAM組、HF組、ARPES組留取心肌組織，-80℃下冷凍保存。采用熒光定量PCR法檢測左心室心肌組織RyR2、CX43在表達水

32、平。
　　 結(jié)果：
　　 1.開胸術后1個月時HF組、ARPES組RyR2、CX43表達水平較SHAM組顯著降低，P＜0.01，而ARPES組較HF組顯著升高，P＜0.01。ARPES-L亞組、ARPES-H亞組間RyR2、CX43表達水平比較，無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。
　　 2.相關分析：對兔心肌組織RyR2、CX43表達水平做相關性分析表明RyR2與CX43表達水平(r=0.5636，P＜0.01)呈正相

33、關。對兔心肌組織RyR2、CX43表達水平和EF、LVSP、+LVdP/dtmax做相關分析，心臟EF、LVSP、+LVdP/dtmax與CX43表達水平(r=0.8350，0.5174，0.7629，P＜0.01)呈正相關，心臟EF、LVSP、+LVdP/dtmax與RyR2表達水平(r=0.6707，0.5480，0.6745，P＜0.01)亦呈正相關。
　　 結(jié)論：兔HF后RyR2、CX43表達水平下降，心室肌收縮力及心臟