雙心室絕對不應(yīng)期電刺激對慢性心力衰竭兔心功能影響的研究.pdf

1、慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心血管疾病的終末狀態(tài)，其病因多種多樣，發(fā)病率高，預(yù)后不良，是心內(nèi)科治療學(xué)上的難題。導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心臟重塑，心臟重塑是心臟結(jié)構(gòu)和功能在受刺激下發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng)，這些適應(yīng)性變化在早期對于維持正常心功能發(fā)揮作用，但隨著心衰進(jìn)程的加重，這些變化導(dǎo)致泵衰竭的進(jìn)展和/惡性心律失常的發(fā)生。
　　心臟重塑包括結(jié)構(gòu)重塑和心電重塑。結(jié)構(gòu)重塑表現(xiàn)為心肌重量、心室容

2、量的增加和心室形狀的改變（橫徑增加呈球狀），心肌收縮力的下降。隨著心臟結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)生心臟電活動的改變，左室電活動的重構(gòu)繼發(fā)于心臟結(jié)構(gòu)的改變。心電重構(gòu)包括多種離子通道、興奮收縮耦聯(lián)（例如肌漿網(wǎng)鈣循環(huán)的變化）和細(xì)胞間縫隙連接的變化。這些變化導(dǎo)致心臟電穩(wěn)定性降低，心臟自律性升高，心室肌細(xì)胞靜息電位和動作電位幅度減小，傳導(dǎo)減慢，動作電位時程延長;同時存在發(fā)生心律失常的血流動力學(xué)基礎(chǔ)，容易發(fā)生以室性心動過速和心室顫動為代表的惡性心律失常。具體體

3、現(xiàn)為心肌興奮性增高、傳導(dǎo)延遲、復(fù)極不均一，心室肌電異步性明顯增大，更易形成折返。
　　慢性充血性心力衰竭動物模型制作方法主要有心肌缺血型、壓力負(fù)荷型、容量負(fù)荷型和心肌病變型等。本研究通過升主動脈環(huán)扎法建立壓力負(fù)荷型慢性充血性心力衰竭動物模型，并觀察心衰后心臟機(jī)械和電生理功能的變化。探索建立慢性心力衰竭動物模型的方法，為研究心力衰竭發(fā)展過程中的血流動力學(xué)改變、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心肌細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的改變提供了重要資料。
　　近年

4、來，CHF的治療取得了巨大的進(jìn)展，但隨著病情的進(jìn)展，許多重癥CHF患者仍有明顯癥狀，藥物治療反應(yīng)不佳。人們在倡導(dǎo)藥物治療的同時，也在積極尋求各種非藥物治療方法，其中心臟移植無疑是治療CHF的最有效方法，但由于供體有限及術(shù)后抗排斥的高額醫(yī)療費用使其應(yīng)用受限。心肌干細(xì)胞移植尚處于基礎(chǔ)研究階段，心臟再同步起搏技術(shù)治療CHF可改善患者的血流動力學(xué)和臨床癥狀，但適應(yīng)范圍有限。
　　傳統(tǒng)的正性肌力藥物地高辛治療，減少因心衰導(dǎo)致的死亡或再住院率

5、。但沒有降低心衰患者的全因死亡率，并且還導(dǎo)致輕微猝死發(fā)生率的增高。其他依賴細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷增加的正性肌力藥物如氨力農(nóng)、米力農(nóng)等因增加慢性心力衰竭患者死亡率已被拋棄。這些藥物顯示在急性期改善心功能的同時伴有心律失常發(fā)生增加的風(fēng)險，特別是在重度左室功能下降、急性缺血或體內(nèi)兒茶酚胺升高的情況下更容易發(fā)生。
　　心臟收縮調(diào)節(jié)（cardiac contractility modulation，CCM）作為一種新的機(jī)械裝置治療方法進(jìn)入人們視線

6、，它是在絕對不應(yīng)期內(nèi)給予的非興奮性刺激(Non-Excitatory Currents，NEC)即絕對不應(yīng)期電刺激，它不會誘發(fā)心肌細(xì)胞產(chǎn)生動作電位，但這個刺激可以使心肌細(xì)胞的這一次收縮能力得到加強(qiáng)。
　　肌漿網(wǎng)鈣ATP酶(SERCA2)又被稱為肌漿網(wǎng)鈣泵，參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)的主要蛋白，能促進(jìn)心肌的收縮和舒張。在每一個心動周期，鈣離子通過鈣釋放通道-雷尼丁受體從肌漿網(wǎng)釋放到細(xì)胞漿，觸發(fā)心肌的收縮。在舒張期，SERCA2逆濃度梯度攝

7、取肌漿內(nèi)鈣離子返回到肌漿網(wǎng)儲存池，以備下次鈣離子的釋放。SERCA2分為SERCA2a、SERCA2b和SERCA2c三種亞型。其中SERCA2a主要在心臟和骨骼肌慢肌纖維中表達(dá)，心臟中主要是SERCA2a，而SERCA2b存在比較廣泛，在各種組織中都有表達(dá)，可部分代替SERCA2a的功能。在慢性心衰情況下，心肌細(xì)胞功能失調(diào)的特征變化之一就是SERCA2a的活性及其mRNA表達(dá)下降，而增加SERCA2a的表達(dá)后可促進(jìn)下降的心肌收縮力得到

8、恢復(fù)，心功能得到改善，這點在動物實驗和臨床研究中都得到證實。
　　miRNAs是一組新發(fā)現(xiàn)的小的非蛋白編碼的核糖核酸，包含有大約19-25個核苷酸序列，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯對基因表達(dá)發(fā)揮重要的調(diào)控作用，被認(rèn)為是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最令人激動的發(fā)現(xiàn)之一。大量證據(jù)表明:miRNAs在心衰發(fā)病機(jī)理方面發(fā)揮重要作用。miRNAs133在心臟中有較高表達(dá)，與心臟肥大有著密切的關(guān)系，有抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，同時具有抗心肌細(xì)胞凋亡，參與調(diào)控心肌重構(gòu)發(fā)揮重要

9、的作用。已有研究證明主動脈縮窄建立的心衰動物模型中，miRNAs133的表達(dá)水平明顯下降。另有研究顯示miRNAs可以綁定到SERCA2a3'端非編碼區(qū)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控SERCA2a的表達(dá)。
　　既往實驗和臨床研究絕對不應(yīng)期刺激多采用單心室刺激的方法，雙心室刺激是否較單心室刺激在改善心功能方面更為有效和安全，本實驗對此進(jìn)行探討。雙心室絕對不應(yīng)期刺激改善心力衰竭心肌的收縮功能和電重構(gòu)，其具體的作用機(jī)制目前尚不清楚，本研究通過熒光定量

10、聚合酶鏈反應(yīng)的方法，分析CCM對兔心衰心室肌SERCA2和miRNAs133基因表達(dá)水平的影響，探討其在分子水平的作用機(jī)制。
　　第一部分、兔慢性充血性心力衰竭時心臟機(jī)械和電生理的變化
　　目的:通過升主動脈環(huán)扎法建立慢性充血性心力衰竭動物模型，觀察心衰后心臟機(jī)械和電生理功能的變化。
　　方法:40只新西蘭大白兔隨機(jī)分為2組:心衰組(n=30)于升主動脈根部遠(yuǎn)端1.0cm處行環(huán)扎縮窄術(shù);假手術(shù)組(n=10)不給予主動脈

11、環(huán)扎，其余步驟同心衰組。術(shù)中及術(shù)后12周行血清BNP、超聲心動圖和心臟電生理檢查。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況:40只新西蘭大白兔，心衰組30只術(shù)中死亡5只，12周后心衰程度沒滿足入選標(biāo)準(zhǔn)2只，造模成功23只;假手術(shù)組10只術(shù)中無死亡，12周后均存活。術(shù)前心衰組和假手術(shù)組體重(Weight)、呼吸頻率(R)和心率(HR)無明顯差別(P＞0.05);12周后心衰組兔表現(xiàn)為精神不振，口唇紫紺，呼吸、心率較假手術(shù)組增加(P＜0.

12、05);體重較假手術(shù)組減少(P＜0.05)。
　　2.慢性心衰兔電生理各項指標(biāo)變化:術(shù)中電生理檢查假手術(shù)組和心衰組各項指標(biāo)無明顯差別（P＞0.05）;術(shù)后12周，心衰組舒張期閾值、有效不應(yīng)期、室顫閾值較假手術(shù)組明顯降低(P＜0.05);而QT間期離散度心衰組較假手術(shù)組相比有增加趨勢，但統(tǒng)計學(xué)分析無明顯差別(P＞0.05)。
　　3.慢性心衰兔超聲心動圖各項指標(biāo)變化:術(shù)前假手術(shù)組和心衰組超聲心功能各項指標(biāo)無明顯差別（P＞0.0

13、5）;術(shù)后12周，心衰組舒張末期室間隔厚度、左室后壁厚度、左室收縮末內(nèi)徑和左室舒張末內(nèi)徑較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05);而左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率和E/A比值心衰組較假手術(shù)組明顯下降(P＜0.05);反映心室機(jī)械收縮不同步指標(biāo)的sPwMD和IVMD，術(shù)后12周心衰組明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。
　　4.慢性心衰兔血清BNP表達(dá)水平的變化:術(shù)前兩組間BNP表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。12周時心衰組血清BN

14、P表達(dá)水平較假手術(shù)組組顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論:升主動脈環(huán)扎縮窄法可有效建立慢性心衰動物模型，心衰后心臟機(jī)械和電生理發(fā)生相應(yīng)的變化。
　　第二部分、雙心室絕對不應(yīng)期刺激對心力衰竭兔心功能的作用
　　目的:觀察雙心室絕對不應(yīng)期電刺激對慢性心力衰竭兔心臟功能和心室結(jié)構(gòu)重塑的影響，探討絕對不應(yīng)期電刺激治療慢性心力衰竭的最佳模式和安全性。
　　方法:23只通過升主動脈根部套扎法建立慢性心力衰竭模型的新西蘭大白

15、兔，將其分為對照組、左室刺激組和雙心室刺激組。左室刺激組和雙室刺激組發(fā)放CCM信號，每天刺激6小時，連續(xù)刺激7天，于電刺激前后觀察心室結(jié)構(gòu)、心臟功能方面的變化。
　　結(jié)果:
　　1.CCM刺激前三組兔超聲心功能各項指標(biāo)(LVEDD、LVESD、EF、FS、IVS、LVPW、E/A)無明顯差別(P＞0.05);CCM刺激后，與對照組相比，左室刺激組和雙心室刺激組LVESD，LVEDD明顯下降，以雙心室刺激組下降更加明顯（P＜0

16、.05）;而LVEF，LVFS，雙心室刺激組和左室刺激組較對照組升高，以雙心室刺激組升高更加明顯(P＜0.05); IVS、IVPW、E峰、A峰和E/A比值各組比較無明顯變化（P＞0.05）。
　　2.CCM刺激對血漿BNP水平的影響:CCM刺激前血漿BNP水平三組相比無明顯差別(P＞0.05);CCM刺激后血漿BNP水平三組相比:雙心室刺激組降低最明顯、其次為左室刺激組(P＜0.05)，對照組較前相比水平?jīng)]有明顯變化分別(P＞0

17、.05)。
　　相關(guān)分析顯示:血清BNP水平與LVESD、LVEDD呈正相關(guān);與LVEF和LVFS呈負(fù)相關(guān)。
　　3.CCM刺激對心室重塑的影響:術(shù)后對三組心衰兔心臟重量和心臟重量指數(shù)比較:左室刺激組和雙心室刺激組心臟重量和心臟重量指數(shù)較對照組下降，以雙心室組下降更加明顯（P＜0.05）。
　　結(jié)論:雙心室絕對不應(yīng)期電刺激可增加慢性心力衰竭心肌的收縮力，改善心功能，逆轉(zhuǎn)心室重塑，較單心室刺激有更大優(yōu)勢。
　　第三

18、部分、雙心室絕對不應(yīng)期刺激對心力衰竭兔心臟電生理的作用
　　目的:探討雙心室絕對不應(yīng)期刺激對心衰心電重構(gòu)有著何種影響，這種影響是繼發(fā)于心臟功能改善的基礎(chǔ)上還是獨立于心室結(jié)構(gòu)重塑，是否會產(chǎn)生新的心律失常危險。
　　方法:23只通過升主動脈根部套扎法建立慢性心力衰竭模型的新西蘭大白兔，將其分為對照組、左室刺激組和雙心室刺激組。左室刺激組和雙室刺激組發(fā)放CCM信號，每天刺激6小時，連續(xù)刺激7天，于電刺激前后觀察電生理指標(biāo)并心律失常

19、變化。
　　結(jié)果:
　　1.CCM刺激后三組兔舒張期閾值的變化:與對照組相比，雙心室刺激組和單心室刺激組在給予CCM刺激后舒張期閾值有升高的趨勢，其中以雙心室刺激組升高更加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.三組兔心肌組織在CCM刺激后有效不應(yīng)期的變化:與對照組相比，雙心室刺激組和單心室刺激組在給予CCM刺激后有效不應(yīng)期有升高的趨勢，其中以雙心室刺激組升高更加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3

20、.CCM刺激后三組兔室顫閾值的變化:與對照組相比，雙心室刺激組和單心室刺激組在給予CCM刺激后室顫閾值有升高的趨勢，其中以雙心室刺激組升高更加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.CCM刺激后三組兔QT間期離散度的變化:與對照組相比，雙心室刺激組和單心室刺激組在給予CCM刺激后QT間期離散度有下降，但統(tǒng)計學(xué)分析無明顯差別(P＞0.05)。
　　5.CCM刺激對心律失常的影響:動態(tài)心電圖監(jiān)測顯示，左室刺激組和雙心室刺激

21、組發(fā)放CCM信號時與信號關(guān)閉時相比未見有心率的變化，且同對照組組相比CCM刺激組未見有室性心律失常的增加。
　　結(jié)論:雙心室絕對不應(yīng)期電刺激可提高舒張期閾值、室顫閾值和延長有效不應(yīng)期，增加心電穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)心衰結(jié)構(gòu)重塑和電重塑，且不增加室性心律失常的發(fā)生，較單心室刺激有更大優(yōu)勢。
　　第四部分、雙心室絕對不應(yīng)期刺激對心衰兔心室肌SERCA2和miRNAs133的影響
　　目的:通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)的方法，分析CCM對

22、兔心衰心室肌SERCA2和miRNAs133基因表達(dá)水平的影響，探討其在分子水平的作用機(jī)制。
　　方法:術(shù)后留取左室心肌標(biāo)本，通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)的方法檢測心肌組織SERCA2和miRNAs133的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.以GAPDH為內(nèi)參照基因，得到目的基因表達(dá)的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計分析。分析顯示:對照組SERCA2a mRNA的RQ值為1.66±0.42;單心室刺激組和雙心室刺激組SE

23、RCA2a mRNA的RQ值分別為3.16±0.74和4.51±0.56;與對照組相比，雙心室刺激組和單心室刺激組在給予CCM刺激后SERCA2a mRNA表達(dá)有升高的趨勢，其中以雙心室刺激組升高更加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.對照組miRNAs133的RQ值為11.91±2.37;單心室刺激組和雙心室刺激組miRNAs133的RQ值分別為31.33±5.16和38.90±6.42;與對照組相比，雙心室刺激組和單