不同基因型玉米對磷脅迫的反應及根系蛋白質組學研究.pdf

1、磷作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，它不僅是核酸和生物膜的重要組分，而且在能量代謝、光合作用、呼吸作用、酶活性調節(jié)、氧化還原反應、信號傳導和碳代謝等方面也扮演重要角色。因此，磷幾乎參與了植物所有的生命活動過程，它的缺乏必然嚴重影響植物的生長發(fā)育和谷物產量。作物主要通過根系吸收土壤中的可溶性磷酸鹽來滿足其磷營養(yǎng)需求。盡管在一些土壤中總磷含量是相當豐富，然而有效磷濃度卻通常在1μM左右，遠不能滿足植物獲取充足磷營養(yǎng)的需求，土壤有效磷不足

2、已成為我國乃至全世界農業(yè)生產中限制谷物產量的主要因素之一。據統(tǒng)計，世界30﹪以上耕地的谷物產量受到磷缺乏限制。為解決土壤有效磷不足的問題，在1960-2000年間磷肥投入量增加了4-5倍，但施入的磷肥80﹪以上被土壤固定，并且在部分地區(qū)造成水域富營養(yǎng)化。照此下去，未來60-80年內地球磷礦資源將被耗盡，土壤有效磷不足和潛在的磷資源匱乏將成為未來農業(yè)的潛在危機。因此，利用作物固有的生物學特性，挖掘作物自身對土壤磷素高效吸收利用的潛力，培育

3、磷高效作物品種，是農業(yè)可持續(xù)發(fā)展和解決上述缺磷及環(huán)境污染問題的一條最有希望的途徑。 玉米在我國乃至世界糧食體系中占有舉足輕重的地位。近年來土壤有效磷不足在許多地區(qū)限制了玉米產量、增加了其生產成本。由于玉米植株高大，生產上利用雜交優(yōu)勢，采用以生物量和產量為尺度篩選磷高效基因型，不僅周期長、工作量大，而且易受環(huán)境干擾、很難準確判斷。植物生物技術的發(fā)展，為獲得玉米磷高效基因型開辟了新途徑，然而這需要充分了解玉米低磷耐受機制。因此，深入

4、研究玉米磷耐受機制具有重要的理論意義和應用價值。 近年來，植物耐低磷機制的研究非?；钴S，也取得了重大進展。低磷耐受機制已被證明是多基因或QTLs控制的數量性狀，一些磷饑餓響應基因在高等植物磷脅迫反應中的作用也已被初步了解。在轉錄組水平上的大量工作表明植物耐低磷脅迫反應是由復雜的調控系統(tǒng)控制的過程。然而，蛋白是細胞功能的執(zhí)行者，蛋白質組學的發(fā)展為植物基因表達分析提供了較為準確和直觀的手段，但在蛋白質組水平上研究植物根系對低磷脅迫應

5、答的工作未見報道。在以前的工作中，本實驗室利用細胞工程技術獲得了一系列具有不同低磷耐受性的玉米材料。經過連續(xù)6代的自交選擇和耐低磷性檢測，我們發(fā)現自交系99038具有穩(wěn)定遺傳的低磷耐受特性和優(yōu)良的農藝性狀，是玉米磷高效育種和低磷耐受機制研究的好材料。本論文以低磷耐受性玉米自交系99038和來源親本齊319為材料，對足磷和缺磷處理條件下兩者的根系形態(tài)和生理生化特性進行了系統(tǒng)的比較；檢測了低磷脅迫下齊319根系蛋白質組的變化并鑒定分析了大量

6、差異表達的蛋白；分別對足磷和缺磷條件下的99038和齊319根系進行了系統(tǒng)的比較蛋白質組學研究，并結合兩者的根系形態(tài)和生理生化特性差異對鑒定的蛋白進行了細致的分析，旨在找出99038較齊319具有更高低磷耐受性的主導因素，為通過基因工程手段進行玉米磷高效育種提供重要參考資料。 一、玉米耐低磷自交系99038和對照齊319的根系形態(tài)和生理生化特性分析連續(xù)數代的觀察發(fā)現，99038植株的地上部分與齊319沒有明顯差別，但根系較齊31

7、9的更發(fā)達，根系形態(tài)具有明顯的差異。由于磷素在土壤中低的移動性，發(fā)達的根系對于植物高效吸收土壤磷素尤為重要。與齊319相比，99038小苗的三條最長根的平均長度、根冠比、側根平均長度和單位質量莖葉所對應的根系吸收面積、根體積、側根數目以及總根長均顯著增加，根平均直徑明顯變細，這一系列變化擴大了根系與土壤的接觸面積和涉獵的土壤體積，提高了99038對磷素的吸收能力。通過檢測不同供磷水平下99038和齊319根系與莖葉的磷含量和磷濃度，以及

8、植株體內磷素的分配，發(fā)現低磷脅迫下99038與齊319相比將更高比例的磷滯留在植株根部，根系含磷量是齊319的1．5倍，根系磷濃度顯著高于齊319，其生長發(fā)育與齊319相比受抑制程度較小(與足磷條件下相比)。酸性磷酸酶活性分析表明，低磷脅迫下兩個基因型玉米老葉和根尖部位的酸性磷酸酶活性均大大提高，但足磷和缺磷條件下齊319和99038相應部位的酸性磷酸酶活性沒有顯著差別，說明酸性磷酸酶活性不是造成兩個基因型玉米低磷耐受性差異的主要因素。

9、根系磷吸收動力學分析表明，在足磷和缺磷條件下99038較齊319均具有更高的I<,max>值，更低的K<,m>和C<,min>．值，具有磷高效特性。根系蛋白表達譜分析得出，在低磷條件下99038和齊319根蛋白表達譜(pH 3-10)中有13.6﹪的蛋白存在質或量的顯著差異(P<0.01)?；谶@些結果，初步認為有可能99038和齊319根蛋白的差異表達導致兩者根系形態(tài)和磷吸收能力的差異，從而導致99038低磷耐受性優(yōu)于齊319；同時證

10、明了細胞工程技術在玉米磷高效育種中具有重要的價值。 二、低磷脅迫下齊319根系生長和代謝改變的蛋白質組分析在對齊319和99038的根系形態(tài)和生理生化特性進行分析中，我們發(fā)現低磷脅迫下盡管齊319和99038的根系形態(tài)和磷吸收特性存在明顯差異，但它們的變化趨勢是一致的，即與足磷條件下相比，它們的根冠比和單位質量莖葉所對應的總根長、側根數目、根體積和根系吸收面積均顯著增加，根平均直徑明顯變細，根系對磷素的吸收能力顯著提高。為了深入

11、了解玉米根系對低磷脅迫的適應機制，取低磷(5μMKH<,2>PO<,4>)和足磷(1000μMKH<,2>PO<,4>)處理17天的齊319根系進行蛋白質組差異分析。雙向凝膠電泳檢測出約1300個蛋白點，其中254個蛋白在足磷和缺磷條件下存在量的顯著差異，占檢測出的蛋白總數的19.5﹪。通過MALDI-TOF MS鑒定出120個差異表達的蛋白，并進行了功能分類分析。這120個鑒定蛋白分布在多個功能種類范圍，包括44個代謝相關蛋白、13個

12、蛋白命運相關蛋白、6個蛋白合成相關蛋白、5個能量代謝相關蛋白、9個次級代謝相關蛋白、7個細胞結構蛋白、11個抗性或與環(huán)境互作相關蛋白、3個轉運相關蛋白、7個轉錄/細胞周期/信號轉導相關蛋白、15個未分類或未知蛋白。其中有些蛋白，如tRNA異戊烯基轉移酶、GTP結合的核蛋白RAN-B1、AraC type：Arac蛋白、嘌呤豐富元件的結合蛋白B類似蛋白和蛋白激酶等，參與激素合成、細胞周期、信號傳導和轉錄調控等過程。這些蛋白可能在連接外部磷

13、濃度改變和植物代謝適應性調控方面扮演重要角色，以調控基因表達，維持細胞相對磷穩(wěn)態(tài)。上述結果從蛋白質組水平上揭示了植物磷饑餓響應是涉及多個信號和代謝途徑的復雜過程，為進一步研究一些磷饑餓響應基因在植物磷營養(yǎng)中的功能提供了重要啟迪。 三、99038和齊319根系蛋白質組差異分析為了了解99038磷高效分子機制和究竟哪些蛋白的差異表達導致99038和齊319根系形態(tài)發(fā)育和磷素吸收能力的顯著差異，我們通過pH 3-6和pH 5-8的IP

14、G膠條對1000μM和5 μM KH<,2>PO<,4>處理17天的99038和齊319根系進行了蛋白質組比較分析。足磷條件下，雙向電泳分離出1260個蛋白點，其中135個(10.7﹪)蛋白點在99038和齊319根中存在量的顯著差異；低磷條件下檢測到1637個蛋白點，其中196個(12.0﹪)蛋白點在兩個基因型間存在量的顯著差異。這些結果表明無論在足磷或缺磷條件下99038和齊319的根系蛋白質組均存在較大差異。我們通過質譜鑒定出99

15、038和齊319根系在足磷條件下呈現顯著差異的79個蛋白點和缺磷條件下呈現顯著差異的108個蛋白點，這些蛋白分布于廣泛的功能種類范圍。差異表達蛋白涉及碳代謝、激素合成、細胞周期和信號轉導等途徑，如碳代謝中的檸檬酸合酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、丙酮酸磷酸二激酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，激素合成及活化途徑中的C-24固醇甲基轉移酶、β-糖苷酶，具有重要調控作用的GTP結合的核蛋白RAN-B1、importin α、MCM6、PP2A、14

16、-3-3、MAPK1、CDC48等，這些蛋白可能在調控玉米根系形態(tài)發(fā)育、細胞周期以及感知外部磷濃度變化等方面扮演重要角色。結合99038和齊319根系形態(tài)和磷吸收能力的差異，推測這些差異蛋白很可能通過參與碳代謝，激素信號途徑或細胞周期運行的差異主導兩基因型根系生長發(fā)育和磷吸收能力的差異。此外，在鑒定的所有差異蛋白中，有18種同功蛋白在足磷和缺磷處理的兩基因型根系中均具有相同的差異表達模式，包括細胞周期調控相關蛋白和大量碳代謝相關蛋白等，

17、它們在99038和齊319根系中的差異表達可認為主要是由基因型不同所致。據此可推測99038和齊319在碳代謝、細胞周期調控等方面存在較大的基因型差異。基于上述結果，99038具有更發(fā)達的根系和更高的低磷耐受性與其碳代謝和細胞增殖調控有利于根系細胞分裂和生長等有關。同時，這些數據也加深了對一些磷饑餓響應基因在玉米磷效率調控中的作用的認識。本論文通過對耐低磷玉米自交系99038和其來源自交系齊319的形態(tài)學、生理學和蛋白質組學的研究，初步