天然水蛭素分離純化研究.pdf

1、水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中所含的一種蛋白質(zhì)，是迄今世界上已發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶特效抑制劑，是一類很有前途的抗凝化瘀藥物。世界各地科學家都在研究水蛭素，有很多關(guān)于水蛭素的報道和專利，但以前人們關(guān)于水蛭素提取的報道大多數(shù)都要殺死整條水蛭來獲得水蛭素，本實驗以南寧科康生物有限公司養(yǎng)殖的菲牛蛭的提取物為原料，將其分離純化條件進行優(yōu)化，以獲得活性更高的水蛭素產(chǎn)物。 實驗首先是比較了硫酸銨分級沉淀鹽析法、有機溶劑沉淀法和pH沉淀法三種蛋白質(zhì)沉

2、淀法對水蛭素分離純化的效果，確定了利用硫酸銨分級沉淀鹽析對水蛭唾液分泌物進行粗分離純化，通過多次離心分段鹽析和兩次離心分段鹽析效果表明：35％～55％飽和度的(NH<,4>)<,2>SO<,4>(W<,a>)是較理想的鹽析范圍，通過正交實驗確定了最佳的正交實驗條件為：40％飽和度的(CH<,4>)<,2>SO<,4>，pH為5.5，靜置時間為20 min，此時蛋白質(zhì)的回收率(W<,p>)=34.37％，水蛭素活性回收率(W<,h>)=6

3、9.33％，水蛭素純化倍數(shù)(R<,hp>)=2.02，比活(S<,p>)=5.33 AT-U/mg。在中間純化和精制過程中，比較了DEAE SephadexA-50和DEAE Sepharose CL-6B兩種離子交換層析樹脂的分離純化效果，確定利用DEAE Sepharose CL-6B作為離子交換層析法的樹脂對水蛭素進行進一步的分離純化。在以DEAE Sepharose CL-6B柱層析純化優(yōu)化實驗中，考察了不同緩沖液、離子洗脫濃度

4、、上樣量及洗脫速度等因素對水蛭素分離純化效果的影響，得知在0.025 mol/mL磷酸鹽緩沖液，0～1.0 mol/mLNaCl的離子洗脫濃度，上樣量為100 mL，洗脫速度為30 mL/h的條件下蛋白質(zhì)的回收率=5.07％，水蛭素活性回收率=77.76％，水蛭素純化倍數(shù)(R<,hp>)=15.34，比活(S<,p>)=191.69 AT-U/mg。在以Sephadex G-25凝膠樹脂的柱層析脫鹽優(yōu)化實驗中考察了洗脫速度因素對水蛭素分

5、離純化效果的影響，得知在30mL/h的洗脫速度的條件下蛋白質(zhì)濃度=0.295 μg/mg，蛋白質(zhì)的回收率=0.27％，水蛭素活性回收率=47.88％，水蛭素純化倍數(shù)(R<,hp>)=8.73，比活(S<,p>)=1017 AT-U/mg。最后利用高效液相色譜(HPLC)對其進行了進一步的分離和檢測，集中收集活性峰，檢測其純度在90％以上。另外，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定了收集到的水蛭素溶液的分子量分布情況并驗證了其純度。天然水蛭素