機(jī)械損傷誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞自噬與凋亡之間作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章：脊髓神經(jīng)元細(xì)胞自噬的鑒定及機(jī)械損傷對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡的影響
　　目的:脊髓神經(jīng)元細(xì)胞機(jī)械性損傷后自噬的鑒定,觀(guān)察機(jī)械性損傷對(duì)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞自噬及凋亡的影響。
　　方法:
　　(1)采用闕海萍介紹的方法建立原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞機(jī)械損傷模型;
　　(2)HE染色以及NSE和DAPI熒光雙標(biāo)記觀(guān)察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài);
　　(3)構(gòu)建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重組質(zhì)粒,采用熒光顯微鏡觀(guān)察熒光斑點(diǎn);電鏡

2、觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),MDC、AO熒光染色,Western Blot檢測(cè)Beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行鑒定;
　　(4)MTT法觀(guān)察機(jī)械損傷對(duì)細(xì)胞活性的影響;
　　(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)機(jī)械損傷對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響;
　　(6)Western Blot檢測(cè)機(jī)械損傷對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)機(jī)械損傷處理后可見(jiàn)大部分神經(jīng)元細(xì)胞軸突和樹(shù)突被切斷,3h后細(xì)

3、胞培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞;
　　(2)HE染色顯示神經(jīng)元細(xì)胞軸突和樹(shù)突清晰,純度大于90％;
　　(3)NSE和DAPI熒光雙標(biāo)記可明顯看到NSE綠色熒光和DAPI紅色熒光,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整;
　　(4)成功構(gòu)建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至神經(jīng)元細(xì)胞中;
　　(5)機(jī)械損傷24h后熒光顯微鏡下觀(guān)察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色斑點(diǎn)積聚;
　　(6)MDC及AO熒光染色顯示機(jī)械損傷

4、24h后神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)大量自噬空泡;電鏡下觀(guān)察到自噬體及凋亡小體形成;
　　(7)機(jī)械損傷24h后神經(jīng)元細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值都達(dá)到高峰;
　　(8)細(xì)胞死亡率隨損傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,24h后細(xì)胞死亡率有所減少;
　　(9)細(xì)胞凋亡率隨損傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,3h后細(xì)胞凋亡率有明顯升高;
　　(10)隨著損傷后時(shí)間的增加,Bcl-2蛋白表達(dá)水平先增加,3h后逐漸減少,而B(niǎo)ax蛋白表

5、達(dá)水平隨損傷時(shí)間逐漸增加。
　　結(jié)論:
　　(1)機(jī)械損傷會(huì)誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞自噬的產(chǎn)生,自噬活性在損傷后24h達(dá)到高峰;
　　(2)機(jī)械損傷會(huì)促使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和壞死,降低細(xì)胞的存活率;
　　(3)神經(jīng)元細(xì)胞在自噬發(fā)生前期可能通過(guò)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)或抑制Bax的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡;
　　(4)采用損傷24h作為后期藥物處理時(shí)間點(diǎn)。
　　第二章：自噬調(diào)控對(duì)機(jī)械性損傷誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞自噬及凋亡影響

6、r>　　目的:探討自噬調(diào)控對(duì)機(jī)械性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞自噬及凋亡影響。
　　方法:
　　(1)分別采用雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤促進(jìn)和抑制細(xì)胞自噬活性;
　　(2)WesternBlot檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;
　　(3)RT-PCR檢測(cè)LC3和Beclin-1的mRNA水平;
　　(4)MTT檢測(cè)自噬調(diào)控對(duì)細(xì)胞活力的影響;
　　(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)自噬調(diào)控對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:

7、
　　(1)雷帕霉素明顯增加了神經(jīng)元細(xì)胞機(jī)械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平,而3-MA在一定程度上降低了神經(jīng)元細(xì)胞機(jī)械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平;
　　(2)雷帕霉素明顯增加了神經(jīng)元細(xì)胞機(jī)械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的mRNA水平,而3-MA在一定程度上降低了神經(jīng)元細(xì)胞機(jī)械損傷后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的mRNA水平;

8、
　　(3)雷帕霉素降低了機(jī)械損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的死亡率,而3-MA提高了細(xì)胞的死亡率;
　　(4)雷帕霉素降低了機(jī)械損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率,而3-MA提高了細(xì)胞的凋亡率;
　　(5)雷帕霉素降低了機(jī)械損傷后神經(jīng)元細(xì)胞Bax的表達(dá),而3-MA增加了Bax的表達(dá);雷帕霉素增加了機(jī)械損傷后神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2的表達(dá),而3-MA在一定程度上降低了Bcl-2的表達(dá);
　　(6)機(jī)械損傷后神經(jīng)元細(xì)胞中p-mTOR和p-AK

9、T的表達(dá)水平明顯降低,mTOR和AKT的表達(dá)水平略有升高;
　　(7)雷帕霉素明顯降低了p-mTOR和p-AKT的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　(1)雷帕霉素提高了神經(jīng)元細(xì)胞的自噬活性,而3-MA在一定程度上抑制了細(xì)胞的自噬活性;
　　(2)雷帕霉素在一定程度上可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和壞死,而3-MA則促進(jìn)了細(xì)胞凋亡和壞死;
　　(3)雷帕霉素抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)增加Bcl-2的表達(dá),降低Bax的表達(dá)來(lái)

10、實(shí)現(xiàn);相反,3-MA促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)增加Bax的表達(dá),降低Bcl-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn);
　　(4)雷帕霉素促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞自噬可能通過(guò)下調(diào)mTOR和AKT磷酸化水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第三章：Beclin-1基因在機(jī)械性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞自噬及凋亡中的作用
　　目的:探討B(tài)eclin-1基因在機(jī)械性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞自噬及凋亡中的作用。
　　方法:
　　(1)構(gòu)建過(guò)表達(dá)Beclin-1重組質(zhì)粒pcDNA-3

11、.1(+)-Beclin-1和沉默Beclin-1表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)-miRNA,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后采用Western Blot驗(yàn)證;
　　(2)Western Blot檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;
　　(3)MTT檢測(cè)過(guò)表達(dá)和沉默Beclin-1對(duì)細(xì)胞活力的影響;
　　(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)表達(dá)和沉默Beclin-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Beclin-1

12、重組質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)-Beclin-1和沉默Beclin-1表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)-miRNA;
　　(2)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的細(xì)胞中Beclin-1表達(dá)水平明顯升高,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的細(xì)胞中Beclin-1表達(dá)水平明顯降低;
　　(3)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞中損傷24h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯

13、增大,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯減小;
　　(4)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞損傷24h后的死亡率有所降低,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡率有所升高;
　　(5)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞損傷24h后的凋亡率有所降低,而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒

14、的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率有所升高;
　　(6)轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞損傷24h后Bcl-2表達(dá)量增加,Bax的表達(dá)量減少;而轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)-miRNA質(zhì)粒的神經(jīng)元細(xì)胞損傷24h后Bax表達(dá)量增加,Bcl-2的表達(dá)量減少。
　　結(jié)論:
　　(1)過(guò)表達(dá)Beclin-1可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)元自噬,而沉默Beclin-1可能會(huì)抑制自噬的發(fā)生;
　　(2)過(guò)表達(dá)Beclin-1