質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188對hemin誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞自噬與凋亡的影響.pdf

1、目的：Hemin可以引起細(xì)胞質(zhì)膜損傷并導(dǎo)致質(zhì)膜完整性的破壞，并進(jìn)一步導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的發(fā)生。本研究期望通過建立體外腦出血模型—hemin損傷模型，探索質(zhì)膜破壞對腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的影響，并探討質(zhì)膜修復(fù)劑P188是否存在神經(jīng)保護(hù)作用及其機制。
　　方法：運用小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系，采用適當(dāng)濃度的hemin（30μM）建立體外出血模型。CCK-8試劑盒檢測海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的存活率；熒光染料碘化丙啶（PI）檢測hemin誘導(dǎo)

2、的質(zhì)膜完整性的破壞程度；Western Blot檢測hemin處理后自噬相關(guān)蛋白LC3，Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bcl-2蛋白的表達(dá)；給予自噬抑制劑3-MA（10mM）及mTOR抑制劑Rapamycin（100nM）后，通過CCK-8及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測自噬在神經(jīng)細(xì)胞損傷中所起的作用；給予質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通過CCK-8檢測P188對hemin引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響；West

3、ern Blot檢測P188對模型中神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白LC3，Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bcl-2的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測P188對細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）變化的影響；給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，Western Blot檢測NAC對模型中神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白LC3，Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bcl-2的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）利用hemin法成功的建立了神經(jīng)元細(xì)胞體外

4、出血模型。CCK-8結(jié)果證實了hemin處理后對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷是劇烈的，并且具有時間及濃度相關(guān)性。PI熒光結(jié)果顯示hemin處理后質(zhì)膜完整性遭到破壞。
　?。?）hemin可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬，且自噬在細(xì)胞死亡中扮演損害作用。Western Blot結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1蛋白在hemin處理后逐步上升（P<0.05），凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3也隨時間地延長逐步上升，抗凋亡蛋白Bcl-2顯著

5、減低（P<0.05）。在加入3-MA后，其損傷相對于單純hemin處理明顯降低，而Rapamycin則進(jìn)一步加劇了hemin的損傷作用，提示自噬在hemin引起的神經(jīng)損傷中扮演促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用。
　?。?）質(zhì)膜修復(fù)劑P188具有神經(jīng)保護(hù)作用。在加入質(zhì)膜修復(fù)劑P188后，PI陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P<0.05），Western Blot結(jié)果顯示LC3，Beclin1及Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯的減低（P<0.05），而Bc

6、l-2的表達(dá)顯著上升（P<0.05），免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示TUNEL（+）/Beclin1（+）也明顯的減少（P<0.05）。
　?。?）P188可以減少細(xì)胞內(nèi) ROS，這可能是其具有抗凋亡及抗自噬功能的機制之一。流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的表達(dá)水平，結(jié)果顯示P188顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，而抗氧化劑NAC也顯著減少ROS的產(chǎn)生。加入NAC后，Western Blot結(jié)果顯示LC3，Beclin1和Caspase-

7、3蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平回升，而NAC與P188聯(lián)合給藥時，與單獨給NAC相比，其損傷程度無明顯改善（P>0.05），且各種蛋白表達(dá)水平也無明顯差異，提示P188可能是通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的水平進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬及凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　1.Hemin對神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生致死性損傷，且伴隨有質(zhì)膜的破壞。
　　2.Hemin產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡伴隨有自噬與凋亡的發(fā)生。