醛固酮增加致密斑細(xì)胞超氧陰離子合成及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)醛固酮增加致密斑細(xì)胞超氧陰離子合成及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：醛固酮誘導(dǎo)致密斑細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子。
　　 目的：近年來，氧化應(yīng)激在高血壓等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用引起人們廣泛關(guān)注。有研究報(bào)道心肌梗死和心衰病人體內(nèi)醛固酮水平明顯增高，會(huì)導(dǎo)致心臟炎癥發(fā)生，該過程伴有心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase2，COX-2)等大量炎性介質(zhì)的釋放。在腦和腸系膜動(dòng)脈

2、中，醛固酮能夠通過釋放一氧化氮(Nitric oxide，NO)介導(dǎo)血管舒張，同時(shí)還能夠激活NAD(P)H氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase)使細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子(Superoxide，O2-)生成增多。在對(duì)體外培養(yǎng)的動(dòng)脈上皮細(xì)胞系研究中也發(fā)現(xiàn)醛固酮通過刺激NAD(P)H(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-ox

3、idase)氧化酶增加O2-的生成。另外，有人提出在臨床治療中及時(shí)糾正氧化/抗氧化失衡，可顯著降低慢性腎衰病人并發(fā)心血管疾病的危險(xiǎn)性。管球反饋(Tubuloglomerular glomerular feedback，TGF)是調(diào)節(jié)腎血流動(dòng)力學(xué)、NaCl排泄和血壓的重要機(jī)制。當(dāng)流經(jīng)腎致密斑血流量增加時(shí)，通過TGF反應(yīng)可引起腎小球入球小動(dòng)脈收縮，從而使腎小球率過濾降低。致密斑(Maculadensa，MD)細(xì)胞釋放一氧化氮可以調(diào)節(jié)TGF功

4、能，而同樣由MD合成的O2-則可使NO失活。我們?cè)诮谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)NAD(P)H氧化酶NOX-2和NOX-4亞型在大鼠MD和MMDD1(Macula dense like cell line)細(xì)胞中都有表達(dá)。雖然醛固酮能誘導(dǎo)心臟和血管發(fā)生氧化或炎癥過程，但其在MD細(xì)胞中的作用機(jī)制還尚不清楚。鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptor，MR)可被醛固酮激活，該受體在機(jī)體中分布廣泛，其中包括腎遠(yuǎn)曲小管和集合管等，但在

5、MD細(xì)胞中是否有表達(dá)卻尚無報(bào)道。我們推測(cè)醛固酮可能通過激活MD細(xì)胞上MR而增加O2-合成，此過程是由COX-2增加和NOX-2、NOX-4激活介導(dǎo)的。該研究有助于進(jìn)一步了解醛固酮引起的氧化應(yīng)激在高血壓和高血壓相關(guān)靶器官(心臟和腎臟等)損傷中的作用，為臨床治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 方法：⑴使用lucigenin增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)MMDD1細(xì)胞中O2-的量。操作步驟主要為，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solu

6、tion，PBS)沖洗細(xì)胞兩次，1 mL胰酶消化1 min，離心，去上清后，加入12 mL Krebs/Hepes緩沖液制備細(xì)胞懸濁液。然后分別進(jìn)行以下五種處理：無處理組：醛固酮(10-8mol/L)組；醛固酮+COX-2阻斷劑(NS39810-6mol/L)組；醛固酮+NAD(P)H阻斷劑(apocynin10-5 mol/L)組；醛固酮+COX-2+NAD(P)H阻斷劑(醛固酮10-8mol/L，NS39810-6 mol/L和ap

7、ocynin10-5mol/L)組。同時(shí)每組加入lucigenin(5×10-6 mol/L)37℃水浴30 min后上機(jī)檢測(cè)。⑵使用RNcasy Mini kit提取MMDD1細(xì)胞和小鼠心肌細(xì)胞tRNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，按以下步驟擴(kuò)增COX-2、NOX-2、NOX-4和MR目的片段。1)1μLcDNA產(chǎn)物，1μL特異性引物，2μL10× PCR緩沖液，1μL dNTP2.5 mmol/L，0.2μL Super Taq酶(5 U

8、/μL)，NOX-2和NOX4的PCR體系中加入1.2μL50％甘油，最后加入去RNAase水使體系總體積達(dá)到20μL。2)PCR條件為：94℃3 min，循環(huán)條件為94℃20 sec，59.4℃(COX-2)，56.6℃(NOX-2)，52.9℃(NOX-4)30 sec，72℃30 sec并循環(huán)40次。最后延長(zhǎng)72℃8 min。3)MR受體的PCR體系為50μL其中包括1μL MMDD1 cDNA或是1μL小鼠心肌cDNA、MR引物

9、和Taq多聚酶。PCR條件為，95℃2 min，循環(huán)條件為95℃40 Sec，退火溫度為58℃40sec，72℃55 sec并循環(huán)40次。最后延伸72℃8 min。電泳分離產(chǎn)物，觀察拍照。β-actin作為內(nèi)參。⑶醛固酮處理MMDD1細(xì)胞30 min后，使用RNeasy Micro kit(Qiagen)提取細(xì)胞tRNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后使用C1000TM Thermal Cycler real-time PCR儀參照說明書進(jìn)

10、行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA。β-actin作為內(nèi)參。⑷使用COX-2 siRNA(Ambion，美國)轉(zhuǎn)染MMDD1細(xì)胞，以沉默COX-2基因。轉(zhuǎn)染使采用siPORTTM Amine Transfection Agent(Ambion，美國)作為轉(zhuǎn)染輔助物。Scrambled siRNA(Invitrogen，美國)作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)流程為：在轉(zhuǎn)染之前24 h，準(zhǔn)備MMDD1細(xì)胞，將細(xì)胞分到6孔細(xì)胞培養(yǎng)盤中

11、(2×105細(xì)胞/孔)，并且使用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)為80％左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染時(shí)，將COX-2 siRNA10 nmol/L和Amine Transfection Agent加入到培養(yǎng)細(xì)胞中共孵育18 h。然后，PBS沖洗細(xì)胞一次后更換正常細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率。⑸RIPA緩沖液(加入蛋白酶抑制劑混合物)離心提取蛋白之后，使用Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度，光波長(zhǎng)度設(shè)定為280 nM。

12、蛋白樣本經(jīng)電泳和轉(zhuǎn)膜后，1％脫脂奶粉TTBS室溫封閉一小時(shí)。根據(jù)研究目的，分別使用以下一抗，包括：1)MR受體-抗混合rMR1-18 clone1D5(1:50)和MRN365 clone2D6(1:100)。2)兔來源抗COX-2抗體(1:500)；兔來源抗NOX-2抗體(1:1000)；3)兔來源抗NOX-4抗體(HRP)(1:1000)；4)小鼠來源抗GAPDH抗體(1:5000)，在4℃孵育過夜。然后TTBS多次沖洗，室溫下辣根

13、過氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(1:10000)孵育1 h(NOX-4除外)，ECL顯影。Western blot條帶采用VersaDoc image analysis system(Bio-Rad)進(jìn)行分析。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。⑹采用單因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Fisher LSD檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為顯著性差異界值。

14、
　　 結(jié)果：①M(fèi)MDD1細(xì)胞上存在MR受體。本實(shí)驗(yàn)從mRNA水平和蛋白水平證實(shí)MMDD1細(xì)胞上有鹽皮質(zhì)激素受體(MR)表達(dá)。②醛固酮通過激活MMDD1細(xì)胞上MR受體產(chǎn)生超氧陰離子O2-。醛固酮(10-8mol/L)處理細(xì)胞30 min后，O2-生成量從1260.9±50.9 RLU·s-1·105cells-1增加到2463.5±145.2 RLU·s-1·105cells-1。而細(xì)胞經(jīng)MR受體拮抗劑eplerenone預(yù)孵育

15、后再加入醛固酮，結(jié)果顯示eplerenone完全阻斷醛固酮誘發(fā)MMDD1細(xì)胞增多超氧陰離子O2-的效果，O2-生成量為1264.4±50.0 RLU·s-1·105cells-4。③RT-PCR結(jié)果顯示MMDD1細(xì)胞上有COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA表達(dá)。④醛固酮增加MMDD1細(xì)胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表達(dá)。平行比較不同濃度醛固酮(10-9mol/L和10-8mol/L)對(duì)MMDD1細(xì)胞，COX-2、NO

16、X-2和NOX-4蛋白表達(dá)量影響，發(fā)現(xiàn)10-8mol/L濃度的醛固酮，蛋白上調(diào)作用最為顯著。醛固酮(10-8mol/L)處理細(xì)胞30 min后，MMDD1細(xì)胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表達(dá)明顯增多，其增加量分別為對(duì)照組的1.78±0.05倍、2.31±0.07倍和2.33±0.14倍。⑤醛固酮通過COX-2、NOX-2和NOX-4影響MMDD1細(xì)胞超氧陰離子O2-生成。我們?cè)谟^察不同阻斷劑對(duì)醛固酮引起MMDD1細(xì)胞O2-合

17、成增多的影響中發(fā)現(xiàn)，NS-398(10-6 mol/L)(COX-2阻斷劑)，apocynin(10-5mol/L)(NAD(P)H氧化酶阻斷劑)或是同時(shí)加入NS-398(10-6mol/L)和apocynin(10-6mol/L)預(yù)處理細(xì)胞都能夠完全阻斷醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞內(nèi)O2-生成增多的作用。⑥siRNA對(duì)MMDD1細(xì)胞中COX-2表達(dá)的影響。COX-2 siRNA顯著降低MMDD1細(xì)胞中COX-2 mRNA表達(dá)。Scramb

18、led siRNA對(duì)COX-2 mRNA則無明顯作用。COX-2 siRNA對(duì)NOX-2 mRNA和NOX-4 mRNA表達(dá)無影響。以上結(jié)果表明該COX-2 siRNA對(duì)MMDD1細(xì)胞中COX-2沉默作用具有特異性和高效性。⑦COX-2 siRNA對(duì)醛固酮誘導(dǎo)MMDD1細(xì)胞超氧陰離子O2-合成增多的影響。使用醛固酮(10-1mol/L)刺激MMDD1細(xì)胞30 min，細(xì)胞中COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA表達(dá)明顯增多。而使用

19、COX-2 siRNA選擇性沉默COX-2后，再用醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞，結(jié)果顯示醛固酮增加COX-2、NOX-2和NOX-4mRNA水平的作用被阻斷。為進(jìn)一步驗(yàn)證COX-2在醛固酮誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子O2-過程中的作用，我們使用COX-2 siRNA預(yù)處理MMDD1細(xì)胞后，再檢測(cè)其中超氧陰離子O2-水平。結(jié)果顯示，醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子O2-釋放增多，而COX-2 siRNA預(yù)處理細(xì)胞則逆轉(zhuǎn)醛固酮該效果。
　　

20、 結(jié)論：在MMDD1細(xì)胞中，醛固酮作用于MR受體，刺激細(xì)胞內(nèi)COX-2表達(dá)增多，激活NAD(P)H氧化酶亞基NOX-2和NOX-4，從而引起細(xì)胞合成超氧陰離子O2-增加。
　　 第二部分：PKCα在醛固酮誘導(dǎo)致密斑細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子中的作用。
　　 目的：醛固酮能激活結(jié)腸和腎小管(遠(yuǎn)端小管、收集小管和集合管等)上皮細(xì)胞上鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptors，MR)，引起電解液流量增加；

21、它還能誘導(dǎo)心臟炎癥和心肌氧化應(yīng)激的發(fā)生。在論文第一部分我們主要闡述了醛固酮通過激活COX-2和NAD(P)H氧化酶導(dǎo)致MMDD1細(xì)胞生成O2-產(chǎn)物增多。但醛固酮該促氧化作用由何種細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)尚不清楚。蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)類固醇類激素發(fā)生快速反應(yīng)的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。有研究報(bào)道醛固酮能增加腎皮質(zhì)集合管細(xì)胞中的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)，該作用是經(jīng)由PKCα信號(hào)通路介導(dǎo)。因此，我們推測(cè)PKCα可能參與了醛固酮

22、通過刺激NOX-2和NOX-4導(dǎo)致MD細(xì)胞中的O2-產(chǎn)物增加的促氧化作用，并在本次研究中對(duì)該假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 方法：（同第一部分）
　　 結(jié)果：⑴NAD(P)H氧化酶抑制劑阻斷醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞產(chǎn)生O2-的作用。醛固酮(10-8mol/L)刺激MMDD1細(xì)胞30 min后，O2-生成量明顯增多，從1293±106 RLU·s-1·105cells-1升高到2349±222 RLU·s-1·105cells-1。

23、同時(shí)加入醛固酮和NAD(P)H氧化酶抑制劑apocynin處理MMDD1細(xì)胞30 min，醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞合成O2-增多的效果被阻斷。⑵PKC抑制劑減弱醛固酮對(duì)MMDD1細(xì)胞促氧化作用。醛固酮(10-8mol/L)處理MMDD1細(xì)胞30 min后，O2-生成量從1184±54 RLU·s-1·105cells-1增加到1982±138 RLU·s-1·105cells-1。同時(shí)加入醛固酮和PKC抑制劑CC(Chelerythri

24、nechloride)刺激MMDD1細(xì)胞30 min，醛固酮誘導(dǎo)MMDD1細(xì)胞O2-合成增多的效果明顯減弱，表明PKC抑制劑阻斷醛固酮促氧化作用。⑶PKCα特異性抑制劑減弱醛固酮促氧化作用。為驗(yàn)證PKC亞型是否參與醛固酮促氧化作用，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用PKCα特異性抑制劑Go6976(Go)。醛固酮(10-8mol/L)明顯增加MMDD1細(xì)胞合成O2-的作用。而同時(shí)加入醛固酮和Go6976(Go)處理細(xì)胞30 min后，醛固酮誘導(dǎo)MMDD1

25、細(xì)胞O2-合成增多的效果被阻斷，表明PKCα參與醛固酮該促氧化作用。⑷PKCα siRNA阻斷醛固酮對(duì)MMDD1細(xì)胞促氧化作用。為進(jìn)一步證實(shí)PKCα在醛固酮促氧化途徑中的作用。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用PKCα siRNA，經(jīng)驗(yàn)證PKCαsiRNA能有效沉默PKCα mRNA。醛固酮(10-8 mol/L)刺激后明顯增加MMDD1細(xì)胞合成O2-量，而使用PKCα siRNA預(yù)處理細(xì)胞18 h則逆轉(zhuǎn)醛固酮該誘導(dǎo)作用。⑸PKCα siRNA阻斷醛固酮

26、誘導(dǎo)的MMDD1細(xì)胞中NOX-2和NOX-4表達(dá)上調(diào)的作用。醛固酮(10-8mol/L)刺激30 min后使MMDD1細(xì)胞內(nèi)NOX-2和NOX-4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而使用PKCα siRNA預(yù)處理則阻斷醛固酮該誘導(dǎo)作用。該結(jié)果表明醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞內(nèi)NOX-2和NOX-4蛋白表達(dá)增加是通過PKCα通路介導(dǎo)。
　　 結(jié)論：醛固酮誘導(dǎo)MMDD1細(xì)胞O2-產(chǎn)物生成增多的作用是由PKCα-NAD(P)H氧化酶途徑介導(dǎo)的。MD細(xì)胞中