重組蛇毒纖溶酶rFⅡ抗脂多糖誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用及機(jī)制研究.pdf

1、彌散性血管內(nèi)凝血(Disseminatedintravasxularcoagulation，DIC)是指以不同原因所致喪失局限性的血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活為特征的獲得性綜合征。DIC的病理生理特征主要是機(jī)體凝血系統(tǒng)及纖維蛋白溶解系統(tǒng)相繼或同時(shí)啟動(dòng)，導(dǎo)致血小板聚集、活化及釋放，凝血因子消耗，彌散性血管內(nèi)特別是毛細(xì)血管內(nèi)纖維蛋白沉積。感染性疾病是導(dǎo)致DIC最常見(jiàn)、最重要的病因之一，其發(fā)病率在DlC常見(jiàn)病因中居于首位。感染性疾病并發(fā)DIC，由于纖維

2、蛋白的沉積及廣泛的微血栓形成，極易導(dǎo)致多器官功能衰竭，病死率高達(dá)70％以上。但是，目前臨床的治療DIC手段有限。肝素是當(dāng)前DIC抗凝治療的基本藥物。然而，動(dòng)物和臨床資料表明，肝素雖能有效地阻斷內(nèi)毒素引起的DIC過(guò)程，但并不能防止多器官功能衰竭和死亡的發(fā)生。且肝素使用不當(dāng)容易造成自發(fā)性出血。而抗凝血酶、水蛭素、活性蛋白C等抗凝藥物用于治療DIC還處于臨床起步試驗(yàn)階段，需要大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)它們的療效。而且它們的出血傾向十分嚴(yán)重，臨床上

3、在DIC治療中的應(yīng)用也是很謹(jǐn)慎的。 雖然溶栓療法用于DIC的治療還處于探索階段，但越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為在早期減少微血栓的形成有可能成為臨床治療DIC、開(kāi)發(fā)新的治療藥物的新思路。重組蛇毒纖溶酶(recombinantfibrinogenaseFII，rFII)是本實(shí)驗(yàn)室用基因工程的方法自行研制的新型溶栓藥。本課題組前期的研究工作證實(shí)，rFII對(duì)纖溶酶原沒(méi)有激活作用，而是直接作用于纖維蛋白，水解纖維蛋白，發(fā)揮溶栓作用。藥物進(jìn)入體內(nèi)溶栓

4、的特異性強(qiáng)，由于對(duì)纖溶酶原沒(méi)有激活作用，因此對(duì)凝血系統(tǒng)的干擾少。 研究目的： 1、研究重組蛇毒纖溶酶rFII對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用。 2、探討重組蛇毒纖溶酶rFII抗脂多糖誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用機(jī)制。 3、為重組蛇毒纖溶酶rFII的開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法及結(jié)果： 1、重組蛇毒纖溶酶rFII的制備用基因工程的方法，構(gòu)建了重組蛇毒纖溶酶rFII的表達(dá)質(zhì)粒，在真核

5、表達(dá)系統(tǒng)酵母菌中獲得高效表達(dá)。經(jīng)過(guò)westernblot檢測(cè)，證明了重組的蛇毒纖溶酶rFII與天然的蛇毒纖溶酶高度同源，其純度達(dá)到SDS-PAGE單一條帶。通過(guò)離子交換和疏水層析，最終獲得了高純度的重組蛇毒纖溶酶rFII。純化的重組蛇毒纖溶酶rFII通過(guò)激光飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜峰單一，其分子量大小為27.4kDa。我們對(duì)重組蛇毒纖溶酶rFII進(jìn)行了HPLC分析，結(jié)果與質(zhì)譜的結(jié)果相一致，表明了重組蛇毒纖溶酶rFII是一個(gè)成分單一的高純

6、度重組蛋白。 2、重組蛇毒纖溶酶rFII對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用采用JoseHermida等的方法建立兔DIC模型。脂多糖(LPS)以100μg/kg/h的速度從兔的一側(cè)耳緣靜脈滴注，同時(shí)對(duì)側(cè)耳緣靜脈給相應(yīng)藥物。實(shí)驗(yàn)分為6組：正常對(duì)照組、DIC模型組、低劑量rFII治療組(O.025mg/kg/hrFII)、中劑量rFII治療組(0.05mg/kg/hrFII)、高劑量rFII治療組(0.1mg/kg/hrFII)

7、、肝素治療組。在給藥前和給藥2、6小時(shí)后分別予以動(dòng)脈取血，測(cè)定血液活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、血小板計(jì)數(shù)及纖維蛋白原的變化情況；分離血漿，測(cè)定給藥前和給藥后2、6小時(shí)的血漿的ALT、BUN水平。實(shí)驗(yàn)24h后處死動(dòng)物，取。腎臟與肝組織，做HE染色及纖維素染色，在光鏡下觀察各臟器組織的變化情況以及纖維蛋白血栓形成情況。觀察實(shí)驗(yàn)兔24小時(shí)內(nèi)生存率。 結(jié)果表明：動(dòng)物給予LPS后，出現(xiàn)呼吸加速及呼吸困難，DIC

8、模型組兔24小時(shí)生存率為38.5％；給予低、中、高劑量rFII治療組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生命體征比較平穩(wěn)，呼吸加速及心率增快明顯改善，其24小時(shí)生存率分別為58.3％、80.0％和78％。DIC模型組兔靜注LPS后，大量血小板與凝血因子被活化，血小板被消耗；纖維蛋白原進(jìn)行性下降；PT、APTT延長(zhǎng)。重組蛇毒纖溶酶rFII組(尤其是高劑量rFII組)的能抑制LPS誘導(dǎo)的纖維蛋白原進(jìn)行性下降和PT、APTT延長(zhǎng)。DIC模型組兔血漿ALT和BUN

9、水平6小時(shí)均迅速升高。重組蛇毒纖溶酶rFII治療組血漿中ALT和BUN的水平明顯降低。DIC模型組兔的肝臟、腎臟均可見(jiàn)纖維蛋白血栓形成。rFII各劑量治療組和肝素治療組的肝臟、腎臟組織光鏡下血管內(nèi)未見(jiàn)明顯血栓形成。HE染色顯示DIC模型組兔肝臟門管區(qū)明顯淤血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及Kupffer氏細(xì)胞增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有較多點(diǎn)狀或片狀出血灶，肝竇及中央靜脈淤血。rFII各劑量治療組和肝素治療組肝組織的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)較對(duì)照組有不同程度減少

10、；肝臟門管區(qū)及肝竇及中央靜脈的淤血亦明顯減少；肝小葉結(jié)構(gòu)也較為正常。腎臟組織HE染色顯示DIC模型組兔腎皮質(zhì)和腎小球缺血性壞死及腎間質(zhì)水腫，rFII各劑量治療組和肝素治療組腎臟損傷情況明顯減弱。 3、重組蛇毒纖溶酶rFII體內(nèi)、外溶栓作用采用肺血栓模型觀察重組蛇毒纖溶酶rFII的體內(nèi)溶栓作用。實(shí)驗(yàn)分為6組：生理鹽水組，1.0、0.3、0.1和0.03mg/kg重組蛇毒纖溶酶rFII組、尿激酶組。生理鹽水組兔肺血栓的濕重為24.8

11、±1.6mg，其干重為6.0±0.3mg。尿激酶組兔肺血栓的濕重為18.0±1.3mg，其干重為4.9±0.2mg。給予1.0、0.3、0.1和0.03mg/kgrFII1小時(shí)后，兔肺血栓的濕重分別為12.6±1.5mg、14.7±1.5mg、18.3±1.1mg和20.1±1.6mg。其血栓的干重分別為3.5±0.4mg、4.0±0.3mg、4.9±0.2mg和5.2±0.2mg。與生理鹽水組相比，有明顯的溶栓作用。1.0、0.3mg

12、/kgrFII溶栓作用要強(qiáng)于10萬(wàn)U/kg的尿激酶。且rFII對(duì)兔肺血栓的溶栓作用呈劑量依賴性。 用纖維蛋白平板法和血平板法測(cè)定重組蛇毒纖溶酶的體外溶栓作用。不同濃度的rFII對(duì)纖維蛋白的降解作用呈劑量和時(shí)間依賴性；在30分鐘時(shí)，rFII降解纖維蛋白的作用較t-PA明顯。在滅活標(biāo)準(zhǔn)纖維平板上，rFII對(duì)纖維蛋白的降解作用呈劑量和時(shí)間依賴性，而t-PA在滅活的纖維蛋白平板沒(méi)有作用。rFII對(duì)兔血平板纖維蛋白的降解作用呈劑量和時(shí)間依

13、賴性；在30分鐘時(shí)，rFII降解纖維蛋白的作用較t-PA明顯。在滅活兔血平板上，rFII對(duì)纖維蛋白的降解作用呈劑量和劑量依賴性，而t-PA在滅活的兔血平板沒(méi)有作用。 4、重組蛇毒纖溶酶rFII體內(nèi)、外降解腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的作用用ELISA法檢測(cè)各組兔血漿中TNF-α的水平。將人、兔、鼠的TNF-α蛋白加入rFII(10μg/ml)在37℃溫育1小時(shí)。進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察反應(yīng)產(chǎn)物的生成情況。用Westernb

14、lot法和免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)；用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞上清中TNF-α的表達(dá)；RT-PCR方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中TNF-αmRNA水平的變化。 5、重組蛇毒纖溶酶rFII底物特異性的研究將各種重組人血漿蛋白fibrinogen、albumin、γ-globulin、transferrin、antitrypsin、lgA、α2-macroglobulin、haptoglobin、laminin、compleme

15、nt3、complement5、complent6、complent9加入重組蛇毒纖溶酶rFII(10μg/ml)在37℃溫育2小時(shí)。用SDS-PAGE觀察反應(yīng)產(chǎn)物的生成情況。測(cè)定rFII的半數(shù)致死量。 結(jié)論： 1、重組蛇毒纖溶酶rFII顯著提高脂多糖誘導(dǎo)兔DIC的生存率。rFII抑制脂多糖誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血兔血漿的ALT、BUN的升高。 2、rFII能有效溶解兔肺血栓。rFII對(duì)纖維蛋白的降解呈時(shí)間和劑量依

16、賴性。rFII對(duì)纖維蛋白有直接降解作用，該作用不依賴于纖溶酶原。 3、重組蛇毒纖溶酶rFII能降低脂多糖誘導(dǎo)的兔血漿TNF－α水平。重組蛇毒纖溶酶rFII對(duì)TNF－α蛋白有直接降解作用。 4、重組蛇毒纖溶酶rFII對(duì)部分血漿蛋白如白蛋白、抗胰蛋白酶、結(jié)合珠蛋白、lgA、轉(zhuǎn)鐵蛋白、層粘連蛋白沒(méi)有明顯的降解作用。有一定的底物特異性。 5、rFII的半數(shù)致死量(LD50)為53.5mg/kg；95％可信限為48.1～5