彌散性血管內(nèi)凝血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文研究目的：1．比較研究普通肝素、低分子肝素、抗凝血酶和重組水蛭素在家兔DIC模型中的抗凝療效；2．比較不同白血病細(xì)胞的纖溶活性及對(duì)白血病細(xì)胞表面尿激酶受體(uPAR)和膜結(jié)合蛋白II(annexinII)的分析，探討全反式維甲酸對(duì)APL細(xì)胞高纖溶狀態(tài)的影響。 方法： 1．不同抗凝劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DIC的治療作用(D建立DIC動(dòng)物模型，脂多糖按2．5mg／kg由兔耳緣靜脈緩慢注入，分兩次給藥，間隔1h，每次脂多糖注射時(shí)間為

2、10min。(2)動(dòng)物分組，將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，對(duì)照組、肝素組、低分子肝素組、抗凝血酶組和重組水蛭素組每組6只，分別于第一次注射脂多糖的同時(shí)在新西蘭大白兔對(duì)側(cè)耳緣靜脈分別注入生理鹽水、肝素鈉100IU／kg、低分子量肝素100U／kg、抗凝血酶100U／kg、重組水蛭素100IU／kg。在注射脂多糖前，注射后2h、4h、6h分別取血，檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原含量、血清纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)

3、、抗凝血酶活性、血小板數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，取心臟、腎臟、脾臟、肺與肝組織經(jīng)甲醛固定，HE染色后在光鏡下觀察纖維蛋白血栓形成。 2．白血病細(xì)胞纖溶活性的體外研究(1)細(xì)胞培養(yǎng)，取指數(shù)生長(zhǎng)期的NB4(急性早幼粒細(xì)胞白血病M3)、SHI．1(急性單核細(xì)胞白血病Ms)、K562(急性紅白血病M6)、Jurkat(急性T淋巴細(xì)胞白血病)和Raji(急性B淋巴細(xì)胞白血病)白血病細(xì)胞，以2×10S／mi接種于玻璃培

4、養(yǎng)瓶，NB4細(xì)胞、K562細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞加含15％小牛血清的RPMll640培養(yǎng)液，SHI-1細(xì)胞加含15％小牛血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加含15％小牛血清的EMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)纖溶酶活性測(cè)定取濃度為2×106傳代培養(yǎng)第3天的NB4、SHI．1、K562、Jurkat、Raji和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，離心去上清后加入纖溶酶原150nmol／L，37~C溫育3h后離心留取上清，用發(fā)色底物法測(cè)上清液的

5、纖溶酶活性。(3)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白血病細(xì)胞尿激酶受體和膜結(jié)合蛋白II的蛋白表達(dá)。(4)KT-PCR半定量分析測(cè)定白血病細(xì)胞尿激酶受體和膜結(jié)合蛋白II的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1．不同抗凝劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DIC的治療作用(1)大白兔注射脂多糖后2h、4h、6hAPTT均明顯延長(zhǎng)，注射脂多糖后6h纖維蛋白原含量下降明顯P<0．01，抗凝血酶活性明顯下降，血小板計(jì)數(shù)呈進(jìn)行性下降；病理檢查心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺組織均可見(jiàn)纖維蛋

6、白血栓形成。(2)肝素組、低分子肝素組、抗凝血酶組和重組水蛭素組APTT均明顯延長(zhǎng)，低分子量肝素組、抗凝血酶組和重組水蛭素組動(dòng)物于注射脂多糖后2h、4h、6h纖維蛋白原含量有逐漸下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肝素組動(dòng)物注射脂多糖后4h、6h纖維蛋白原含量有明顯下降；各抗凝治療組凝血因子X(jué)活性的下降受到不同程度的抑制；各治療組動(dòng)物注射脂多糖后血小板也顯著下降，肝素治療組更明顯：家兔心臟、肝臟、腎臟、脾和肺組織光鏡下血管內(nèi)未見(jiàn)明顯血栓形成。

7、 2.　啟血病細(xì)胞纖溶活性的體外研究(1)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相比，NB4細(xì)胞和SHI．1細(xì)胞與纖溶酶原作用后上清液纖溶酶活性明顯升高，(P<0．01)。(2)ATRA處理后的NB4細(xì)胞纖溶活性明顯下降，ATRA對(duì)SHI．1、K562、Raji、Jurkat細(xì)胞的纖溶活性無(wú)影響。(3)SHI．1細(xì)胞uPAR陽(yáng)性表達(dá)率為(99．00±0．26)％，NB4細(xì)胞uPAR陽(yáng)性表達(dá)率為(13．15±L61)％，ATRA可明顯降低NB4細(xì)胞uPA

8、R的表達(dá)，對(duì)SHI．1和Jurkat細(xì)胞uPAR的表達(dá)無(wú)影響。(4)NB4細(xì)胞annexinII陽(yáng)性表達(dá)率為(95．97±1．19)％，SHI-1細(xì)胞annexinII陽(yáng)性表達(dá)率為(90．35±2．15)％，ATRA能下調(diào)NB4細(xì)胞annexinII的表達(dá)，(P<0．01)但對(duì)SHI．1、K562、Raii、Jurkat細(xì)胞annexinII的表達(dá)無(wú)影響。(5)NB4細(xì)胞、SHI-1細(xì)胞、K562細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞中均檢測(cè)到uPAR

9、基因的表達(dá)，SHI-1細(xì)胞和NB4細(xì)胞uPARmRNA表達(dá)較高，ATRA作用后，NB4細(xì)胞uPARmRNA表達(dá)下調(diào)，(P＜0．05)：ATRA對(duì)SHI．1細(xì)胞、K562細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞uPAR基因表達(dá)無(wú)影響。(6)annexinⅡmRNA在NB4細(xì)胞和SHI．1細(xì)胞呈高表達(dá)，Raji細(xì)胞中低表達(dá)，ATRA可明顯下調(diào)NB4細(xì)胞annexinIImRNA表達(dá)，ATRA對(duì)Raii細(xì)胞、K562細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞annexinIImR

10、NA表達(dá)無(wú)影響。 結(jié)論： 1．凝血酶在DIC的發(fā)生中起著核心的作用。拮抗凝血酶的活性是DIC治療的重要措施，無(wú)論是凝血酶的直接抑制劑還是間接抑制劑，均能有效地抑制DIC的微循環(huán)血栓的形成。 2．在DIC的治療中，不同的凝血酶抑制劑的治療效果不完全相同，重組水蛭素和抗凝血酶優(yōu)于低分子肝素和肝素，低分子肝素的療效和肝素相似，但對(duì)血小板影響小。 3．不同白血病細(xì)胞使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶的能力不同，其中SHI-l