線蟲生殖毒理學(xué)替代模型的構(gòu)建及在毒死蜱生殖毒性研究中的應(yīng)用.pdf

1、農(nóng)藥的長期廣泛使用對人群生殖健康具有潛在的健康危害，而傳統(tǒng)的毒理學(xué)評價方法已遠(yuǎn)不能滿足對生殖毒性化學(xué)物快速篩檢和機(jī)制研究的需要，隨著動物實驗減少、替代、優(yōu)化“3R”原則的提出，建立快速、敏感的生殖毒性替代模型已成為現(xiàn)代毒理學(xué)發(fā)展的需要和社會進(jìn)步的體現(xiàn)。歐盟在其動物實驗禁止令中規(guī)定：自2009年禁止所有采用動物實驗的化妝品在歐盟市場銷售，自2013年禁止在反復(fù)染毒毒性、生殖毒性和毒物動力學(xué)測試中使用動物，充分體現(xiàn)出時代發(fā)展對毒理學(xué)替代方法

2、的需要。線蟲因具有遺傳背景清晰、進(jìn)化高度保守、結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短等特點(diǎn)，近年在毒理學(xué)研究中受到關(guān)注。本研究通過構(gòu)建線蟲生殖毒性替代模型，探討線蟲模型在農(nóng)藥生殖毒性研究中的潛在應(yīng)用價值。
　　研究目的
　　構(gòu)建秀麗隱桿線蟲生殖毒理學(xué)替代模型及其評價指標(biāo)體系；通過分析比較有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱對線蟲和小鼠的生殖毒性，探討秀麗隱桿線蟲生殖毒理學(xué)替代模型用于生殖毒性化學(xué)物篩檢和機(jī)制研究的可行性，為其應(yīng)用于生殖毒性化學(xué)物的篩檢及機(jī)制研究提

3、供依據(jù)。
　　方法和結(jié)果
　　1.秀麗隱桿線蟲生殖毒理學(xué)替代模型的構(gòu)建
　　1.1秀麗隱桿線蟲生殖系統(tǒng)對農(nóng)藥的敏感性實驗
　　毒死蜱、吡蟲啉、噻嗪酮、氯氟氰菊酯、草甘膦等五種替代農(nóng)藥，以0.001、0.01、0.1和1.0mgL-1四個級別的暴露濃度，分別暴露于L4期野生型雌雄同體線蟲24和72h，觀察后代數(shù)目(反映生殖能力)和世代時間(反映生殖速度)的變化，探討線蟲生殖系統(tǒng)對農(nóng)藥的敏感性。結(jié)果顯示：后代數(shù)目在線

4、蟲分別暴露于噻嗪酮和氯氟氰菊酯24h后顯著降低，在分別暴露于五種農(nóng)藥72h后隨暴露濃度的升高而下降，毒死蜱0.3、3.0mgL-1劑量組和草甘膦7.0mgL-1劑量組與對照有顯著性差異；世代時間在線蟲暴露于3.0mgL-1毒死蜱或3.0mgL-1噻嗪酮24h后顯著延長。
　　1.2生育力毒性評價模型的構(gòu)建
　　以氯氰菊酯作為生殖毒性代表性物質(zhì)，觀察L4期野生型雌雄同體線蟲暴露于0.08、0.8和8.0mgL-1氯氰菊酯24、

5、48和72h后，后代數(shù)目、子宮內(nèi)受精卵數(shù)、體外排受精卵速率對氯氰菊酯生殖毒性的反應(yīng)，評價線蟲生育力毒性評價模型的有效性。結(jié)果顯示后代數(shù)目在線蟲暴露于0.8和8.0mgL-1氯氰菊酯72h后顯著降低，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，表明氯氰菊酯生殖毒效應(yīng)在線蟲和哺乳動物之間具有一致性。子宮內(nèi)受精卵數(shù)在線蟲暴露于0.8和8.0mgL-1氯氰菊酯48h后顯著下降，具有劑量效應(yīng)關(guān)系。體外排受精卵速率在線蟲暴露48h后，各劑量組均顯著低于對照組，但無劑量效應(yīng)關(guān)

6、系。
　　1.3精子發(fā)生毒性評價模型的構(gòu)建
　　以環(huán)磷酰胺作為精子發(fā)生毒性代表性物質(zhì)，觀察L4期雄蟲突變體暴露于0.02、0.2、2.0、20.0mgL-1環(huán)磷酰胺48h后，后代數(shù)目、精細(xì)胞形態(tài)和精子運(yùn)動對環(huán)磷酰胺精子毒性的反應(yīng)，評價線蟲精子發(fā)生毒性評價模型的有效性。雜交試驗顯示環(huán)磷酰胺引起線蟲后代數(shù)目下降，2.0和20.0mgL-1劑量組有顯著性下降。精細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示各劑量組非圓形精細(xì)胞百分率和精細(xì)胞直徑與對照有顯著性

7、差異，非圓形精細(xì)胞百分率隨濃度增高而增高，精細(xì)胞直徑隨濃度增高而減少，均表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，表明環(huán)磷酰胺精子致畸毒效應(yīng)在線蟲和哺乳動物之間具有一致性。精子運(yùn)動試驗結(jié)果顯示精子活化率在0.2-20.0mgL-1暴露水平顯著低于對照組，活動精子百分率在2.0和20.0mgL-1暴露水平顯著性下降，均表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　1.4卵子發(fā)生毒性評價模型的構(gòu)建
　　以甲氧滴滴涕作為生殖毒性代表性物質(zhì)，將L4期雌蟲突變體、野生型雌雄同

8、體線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲分別暴露于0.03、0.3、3.0和30.0mgL-1甲氧滴滴涕24、48和72h，觀察后代數(shù)目、DTC細(xì)胞(維持生殖干細(xì)胞的生長)、卵子發(fā)生不同階段生殖細(xì)胞(有絲分裂細(xì)胞、減數(shù)分裂粗線期凋亡細(xì)胞、減數(shù)分裂終變期卵母細(xì)胞)等對甲氧滴滴涕生殖毒性的反應(yīng)，評價線蟲卵子發(fā)生毒性評價模型的有效性。雜交試驗顯示后代數(shù)目在線蟲暴露48或72h后，自3.0mgL-1暴露水平開始顯著下降。DTC細(xì)胞熒光強(qiáng)度在線蟲暴露于30.0mgL-

9、1甲氧滴滴涕72h后顯著下降。卵子發(fā)生不同階段生殖細(xì)胞觀察結(jié)果顯示：有絲分裂細(xì)胞數(shù)在線蟲暴露48或72h后，自3.0mgL-1暴露水平開始顯著下降；凋亡細(xì)胞數(shù)在線蟲暴露48或72h后，在0.3-30.0mgL-1劑量組有顯著性增高，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，表明甲氧滴滴涕促細(xì)胞凋亡毒效應(yīng)在線蟲和哺乳動物之間具有一致性；終變期卵母細(xì)胞發(fā)育狀況顯示暴露72h后，卵母細(xì)胞數(shù)自3.0mgL-1暴露水平開始顯著減少，-2卵母細(xì)胞相對長度自0.3mgL-

10、1暴露水平顯著性降低，未受精卵母細(xì)胞數(shù)在3.0和30.0mgL-1劑量組顯著增高。
　　2.毒死蜱對秀麗隱桿線蟲的生殖毒性作用與機(jī)制
　　2.1毒死蜱對秀麗隱桿線蟲生育力的毒性作用
　　將L4期雌雄同體線蟲分別暴露于0.003、0.03、0.3和3.0mgL-1毒死蜱48和72h，觀察后代數(shù)目、子宮內(nèi)受精卵數(shù)的變化，研究毒死蜱對線蟲生育力的毒作用。結(jié)果顯示暴露組線蟲生育力降低，表現(xiàn)為后代數(shù)目在線蟲暴露72h后，自0.3

11、mgL-1劑量組顯著減少，子宮內(nèi)受精卵數(shù)在線蟲暴露48或72h后，自0.3mgL-1劑量組顯著降低。
　　2.2毒死蜱對秀麗隱桿線蟲精子發(fā)生的毒性作用與機(jī)制
　　應(yīng)用前期構(gòu)建的線蟲精子發(fā)生毒性評價模型，以L4期雄蟲突變體分別暴露于0.003、0.03、0.3和3.0mgL-1毒死蜱48h，觀察后代數(shù)目、精細(xì)胞形態(tài)和精子運(yùn)動、精子發(fā)生基因表達(dá)水平的變化，研究毒死蜱對線蟲精子發(fā)生的毒性作用與機(jī)制。雜交試驗顯示雄蟲后代數(shù)目在3.0

12、mgL-1劑量組顯著降低。精細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示暴露組線蟲精細(xì)胞發(fā)育受抑，表現(xiàn)為精細(xì)胞直徑自0.003mgL-1暴露水平顯著下降，非圓形精細(xì)胞百分率自0.03mgL-1暴露水平顯著增高。精子運(yùn)動試驗顯示毒死蜱降低精子運(yùn)動能力，精子活化率在0.03-3.0mgL-1暴露水平顯著低于對照組，活動精子百分率在0.3和3.0mgL-1劑量組顯著下降。
　　RT-qPCR檢測線蟲組織中精細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因spe-10、spe-15，精子運(yùn)動相關(guān)

13、基因prg-1、fer-1和精子數(shù)量相關(guān)基因廠folt-1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示暴露組線蟲精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)水平普遍降低，表現(xiàn)為spe-10基因表達(dá)水平在各劑量組均顯著下降，spe-15基因表達(dá)水平在0.3和3.0mgL-1劑量組顯著降低，prg-1基因表達(dá)水平在各劑量組均顯著下降，fer-1和folt-1基因表達(dá)水平在3.0mgL-1劑量組顯著性降低。
　　2.3毒死蜱對秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的毒性作用與機(jī)制
　　應(yīng)

14、用構(gòu)建的線蟲卵子發(fā)生毒性評價模型，將L4期雌蟲突變體、野生型雌雄同體線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲分別暴露于0.003、0.03、0.3和3.0mgL-1毒死蜱48、72h，觀察后代數(shù)目和不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞的變化，檢測細(xì)胞凋亡和卵子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)水平，系統(tǒng)研究毒死蜱對線蟲卵子發(fā)生的毒性作用與機(jī)制。雜交試驗顯示暴露72h雌蟲的后代數(shù)目在0.3和3.0mgL-1劑量組顯著降低。不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞觀察結(jié)果顯示：有絲分裂細(xì)胞數(shù)在線蟲暴露48和72h后，

15、在0.3和3.0mgL-1劑量組顯著減少；減數(shù)分裂粗線期凋亡細(xì)胞數(shù)在線蟲暴露48和72h后，自0.03mgL-1暴露水平顯著增高；減數(shù)分裂終變期卵母細(xì)胞表現(xiàn)為發(fā)育受阻，72h暴露后，卵母細(xì)胞數(shù)在0.3和3.0mgL-1劑量組顯著降低，-2卵母細(xì)胞相對長度自0.03mgL-1暴露水平顯著性下降，未受精卵母細(xì)胞數(shù)在0.3和3.0mgL-1劑量組顯著性增高。
　　RT-qPCR檢測72h暴露線蟲的凋亡相關(guān)基因ced-3、ced-4和ce

16、d-9，卵母細(xì)胞形態(tài)相關(guān)基因glp-1和卵母細(xì)胞功能相關(guān)基因mlh-1、cyb-3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：促凋亡基因ced-3和ced-4表達(dá)水平分別在0.03-3.0和0.003-3.0mgL-1劑量組顯著升高，抑凋亡基因ced-9表達(dá)水平在各劑量組均顯著降低；glp-1基因表達(dá)水平在0.03-3.0mgL-1劑量組顯著升高；卵母細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)水平普遍下降，表現(xiàn)為cyb-3和mlh-1基因表達(dá)水平分別在0.003-3.0和

17、0.3、3.0mgL-1劑量組顯著下降。
　　3.毒死蜱對小鼠的生殖毒性作用與機(jī)制
　　3.1毒死蜱對小鼠精子發(fā)生的毒性作用與機(jī)制
　　以7.5、15.0和30.0mgkg-1毒死蜱對ICR成年雄鼠灌胃染毒(5d/w，35d)，觀察其一般狀況、生殖器官、精子參數(shù)、精子發(fā)生通路候選基因表達(dá)水平的變化，探討毒死蜱的精子發(fā)生毒性作用及機(jī)制。結(jié)果顯示：中高濃度毒死蜱暴露后，小鼠出現(xiàn)易激惹等行為學(xué)改變。組織病理學(xué)檢查表現(xiàn)為暴露小

18、鼠睪丸出現(xiàn)退行性病變，曲細(xì)精管排列稀疏，間隙增寬，各級生精細(xì)胞數(shù)目減少，腔內(nèi)精子數(shù)減少，支持細(xì)胞萎縮，病變程度隨暴露濃度的增高而逐漸加重；暴露組附睪體腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。精子形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示精子畸形率隨暴露濃度增高而上升，中高劑量組與對照有顯著性差異。精子能動性檢測顯示運(yùn)動精子百分率隨暴露濃度增高而下降，高劑量組顯著降低。
　　RT-qPCR檢測小鼠睪丸組織中與線蟲spe-10同源的zdhhc20基因、與prg-1同源的piwil

19、基因、與fer-1同源的dysf基因表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示：小鼠同源基因表達(dá)水平普遍下降，表現(xiàn)為zdhhc20和piwil基因表達(dá)水平在中高劑量組顯著下降，dysf基因在高劑量組表達(dá)水平降低，但與對照無顯著性差異。
　　3.2對小鼠卵子發(fā)生的毒性作用與機(jī)制
　　以7.5、15.0和30.0mgkg-1毒死蜱對ICR成年雌鼠灌胃染毒(6d/w，14d)，觀察其一般狀況、生殖器官、凋亡基因表達(dá)水平的變化，研究毒死蜱卵子發(fā)生毒性

20、作用及機(jī)制。結(jié)果顯示：小鼠終末體重和增重隨暴露濃度增高而下降，高劑量組顯著降低。組織病理學(xué)檢查顯示卵巢皮質(zhì)中卵泡發(fā)育受阻，表現(xiàn)為中、高劑量組原始卵泡和閉鎖卵泡數(shù)目增多，顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)隨暴露濃度增高而增高，高劑量組顯著升高。
　　RT-qPCR檢測小鼠卵巢組織中與線蟲ced-3同源的mch3核苷酸片段、與ced-9同源的bcl-2基因表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示：促凋亡發(fā)生的mch3核苷酸片段表達(dá)水平隨暴露濃度升高而升高，中高劑量組與

21、對照有顯著性差異；抑凋亡基因bcl-2表達(dá)水平在中高劑量組顯著下降。
　　4.秀麗隱桿線蟲生殖毒理學(xué)替代模型的可行性分析
　　線蟲遺傳性狀穩(wěn)定，體積小，試驗占地和試劑消耗都較哺乳動物大為減少。且其生長繁殖快，易于獲取，本課題構(gòu)建的線蟲生殖毒性試驗一般1-2周內(nèi)均可完成，與哺乳動物生殖毒性試驗相比極大縮短了試驗周期。
　　毒死蜱在小鼠模型和線蟲模型中均能引起精子/精細(xì)胞形態(tài)異常、精子能動性下降、凋亡細(xì)胞增高，具有劑量效應(yīng)

22、關(guān)系，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示毒死蜱暴露引起線蟲和小鼠同源基因(spe-10和zdhhc20、prg-1和piwil、fer-1和dysf、ced-3和mch3、ced-9和bcl-2)mRNA表達(dá)水平改變，變化趨勢相似，表明毒死蜱的生殖毒效應(yīng)在線蟲與哺乳動物之間具有一致性。
　　初步結(jié)論
　　1.線蟲生殖系統(tǒng)對受試農(nóng)藥具有較高的敏感性。
　　2.線蟲生育力毒性評價模型應(yīng)用后代數(shù)目和子宮內(nèi)受精卵數(shù)等評價指標(biāo)可有效、定

23、量地反映外源性化學(xué)物生育力毒性。
　　3.線蟲精子發(fā)生毒性評價模型終點(diǎn)判定明確、試驗操作簡單，精細(xì)胞直徑、非圓形精細(xì)胞百分率、精子活化率和活動精子百分率等評價指標(biāo)有較高敏感性，能特異性反映外源性化學(xué)物對精細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、精子活化和精子運(yùn)動毒性作用的特征。
　　4.線蟲卵子發(fā)生毒性評價模型通過有絲分裂細(xì)胞數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)、卵母細(xì)胞數(shù)、卵母細(xì)胞大小、未受精卵母細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)觀察，可反映外源性化學(xué)物對有絲分裂期生殖細(xì)胞增殖、減數(shù)分裂粗線

24、期和減數(shù)分裂終變期卵母細(xì)胞發(fā)育各階段的毒性作用，終點(diǎn)判定明確、敏感性高，試驗操作簡單。
　　5.毒死蜱暴露后，可通過下調(diào)線蟲精子發(fā)生通路上spe-10、spe-15、prg-1、fer-1、folt-1、基因的表達(dá)水平，降低精細(xì)胞直徑、提高非圓形精細(xì)胞百分率、降低精子活化率和精子運(yùn)動能力，說明毒死蜱對精細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和精子運(yùn)動具有抑制作用，提示精子發(fā)生損傷是毒死蜱發(fā)揮生殖毒效應(yīng)的重要途徑之一。
　　6.毒死蜱暴露后，可致線蟲有

25、絲分裂細(xì)胞數(shù)降低，通過下調(diào)ced-9，上調(diào)ced-3和ced-4基因的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)glp-1基因的表達(dá)致卵母細(xì)胞體積減小，下調(diào)mlh-1和cyb-3基因的表達(dá)降低卵母細(xì)胞功能，說明毒死蜱可通過抑制生殖細(xì)胞增殖、促細(xì)胞凋亡、抑制終變期卵母細(xì)胞發(fā)育等途徑損傷卵子發(fā)生，提示卵子發(fā)生損傷是毒死蜱生殖毒性作用的重要途徑之一。
　　7.毒死蜱經(jīng)口暴露35天損傷雄性小鼠生殖能力，表現(xiàn)為精子數(shù)量下降，畸形精子發(fā)生率增高，精子運(yùn)動能

26、力下降，睪丸組織出現(xiàn)病理改變；小鼠中線蟲精細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和運(yùn)動相關(guān)基因的同源基因zdhhc20、piwil和dysf表達(dá)水平顯著下降，提示zdhhc20、piwil和dysf基因可能是毒死蜱對小鼠精子形態(tài)發(fā)生和運(yùn)動功能毒作用的特異性應(yīng)答基因。表明毒死蜱小鼠精子毒性試驗結(jié)果和線蟲精子發(fā)生毒性試驗結(jié)果具有一致性。
　　8.毒死蜱經(jīng)口暴露14天，對雌性小鼠具有生殖毒性，通過上調(diào)mch3核苷酸片段和下降bcl-2基因的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡