轉(zhuǎn)染有骨形成蛋白-2、7真核表達(dá)載體的MG63細(xì)胞與殼聚糖膜組合的生物學(xué)性能研究.pdf

1、背景:
　　 骨缺損是一類常見(jiàn)、多發(fā)且治療復(fù)雜的疾患,因創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等后天因素及先天畸形等原因造成,累及外顯和功能部位,不僅給患者造成嚴(yán)重的形態(tài)畸形和功能障礙,也成為困擾臨床醫(yī)師的一大難題。近年來(lái),隨著材料科學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展,組織工程學(xué)作為高新技術(shù)成為一門與多學(xué)科交叉的新興邊緣學(xué)科隨之應(yīng)運(yùn)而生,并得到了迅速的發(fā)展,利用組織工程學(xué)方法構(gòu)建組織工程骨已成為骨移植材料的研究熱點(diǎn)。
　　 目的:
　　 殼聚糖(chi

2、tosan,CS)材料與種子細(xì)胞具有較好的生物相容性是決定殼聚糖在骨組織工程中應(yīng)用的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染有成骨生物活性因子基因的細(xì)胞與殼聚糖膜材料共同培養(yǎng),通過(guò)細(xì)胞增殖、粘附實(shí)驗(yàn),觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞與殼聚糖膜支架材料的生物相容性。
　　 方法:
　　 1骨形成蛋白-2,7真核表達(dá)載體的構(gòu)建:
　　 1.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建:分別構(gòu)建BMP-2/pcDNA3.1(-)、BMP-7/pcDNA3.1(-)表達(dá)載體,并經(jīng)測(cè)

3、序、雙酶切、PCR鑒定。
　　 1.2將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)hBMP-2、hBMP-7mRNA水平表達(dá),通過(guò)Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)hBMP-2、hBMP-7蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　 2轉(zhuǎn)染細(xì)胞在殼聚糖膜表面的增殖與分化情況的研究:
　　 2.1 MTS增殖檢測(cè):將材料及細(xì)胞置于96孔板中培養(yǎng),分正常MG63組,MG63/CS組;轉(zhuǎn)染BMP-2組,轉(zhuǎn)

4、染BMP-2/CS組;轉(zhuǎn)染BMP-7組,轉(zhuǎn)染BMP-7/CS組,在24h、48h、72h、96h時(shí),MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 2.2掃描電鏡檢測(cè):將材料及細(xì)胞于24孔板中,分為MP-2/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組與BMP-7/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組,培養(yǎng)24h、72h、120h,收集準(zhǔn)備樣本,掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建:經(jīng)測(cè)序

5、、雙酶切、PCR鑒定,結(jié)果表明成功構(gòu)建了BMP-2/pcDNA3.1(-)、BMP-7/pcDNA3.1(-)表達(dá)載體。
　　 2.轉(zhuǎn)染及表達(dá):RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有目的基因的表達(dá),Westernblot及細(xì)胞免疫組化法均檢測(cè)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有目的蛋白BMP-2、BMP-7的表達(dá),表明轉(zhuǎn)染后重組載體在MG63細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　 3.MTS增殖實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染細(xì)胞在材料上培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)MTS檢測(cè)值的增長(zhǎng)表

6、明隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞在材料表面能生長(zhǎng)增殖。但與正常MG63細(xì)胞組相比,轉(zhuǎn)染組的增殖無(wú)明顯差異(P＞0.05),表明體外殼聚糖材料對(duì)載有轉(zhuǎn)染有目的基因的MG63細(xì)胞的增殖無(wú)明顯促進(jìn)作用。
　　 4.掃描電鏡觀察:分為BMP-2/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組與BMP-7/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組,于培養(yǎng)24h、72h、120h時(shí)的電鏡照片顯示分別轉(zhuǎn)染有BMP-2、BMP-7基因的MG63細(xì)胞在殼聚糖