五甲基槲皮素抗代謝綜合征的作用及作用機制研究.pdf

1、第一部分建立谷氨酸鈉誘導的代謝綜合征小鼠模型
　　目的:乳鼠皮下注射MSG誘導MetS小鼠模型。
　　方法:健康昆明小鼠(雌雄各半,10周齡),由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供。適應性飼養(yǎng)2周,至12周齡時,按照雄雌1:1比例進行配種。保持飼養(yǎng)間溫度22±2℃,濕度55±5％及12h光照周期。出生后雄性乳鼠于出生后2-8天皮下注射MSG(3mg/g/d,生理鹽水(Saline)溶解)或Saline。待乳鼠21日齡時斷

2、乳分籠,分成Saline組和MSG組,n=10。每周監(jiān)測各組小鼠的體重及攝食量。飼養(yǎng)至18周齡時,記錄小鼠體重、腰圍、體長,取禁食血液分離血清,檢測各組小鼠的血清血糖、甘油三脂、總膽固醇、胰島素水平。后宰殺,分離相應組織器官,稱重、記錄,凍存?zhèn)錅y。Western blot方法分析小鼠肌肉組織中AMP激活的蛋白激酶(AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)以及葡萄糖轉運因子4(GLUT4)的蛋白表達水平。
　　結果:(1)MSG小鼠出

3、現(xiàn)了明顯的肥胖。與對照組Saline小鼠比較,MSG小鼠表現(xiàn)出向心性肥胖體征,其體重(增加18％)、腰圍(增加26％)、Lee指數(shù)(增加17％)以及脂肪含量(增加734％)均顯著增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(p<0.001)。(2)MSG小鼠空腹血糖水平升高。通過對MSG小鼠空腹血糖水平的檢測,發(fā)現(xiàn)MSG小鼠血糖明顯升高,與Saline小鼠血糖值比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。(3)MSG小鼠出現(xiàn)了脂代謝紊亂。與Saline小鼠

4、比較,MSG小鼠表現(xiàn)出較高的血清甘油三脂(TG)和總膽固醇(TC)水平(TG升高:52％,TC升高:49％)。(4)MSG小鼠出現(xiàn)了高胰島素血癥和胰島素抵抗。MSG小鼠的血清胰島素水平明顯升高(p<0.001),計算的胰島素抵抗指數(shù)表明,與對照組Saline小鼠比較,MSG小鼠已存在顯著的胰島素抵抗(p<0.001)。(5)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)MSG小鼠肌肉組織中的AMPK信號通路以及GLUT4蛋白表達發(fā)生了改變,表現(xiàn)為:A

5、MPK、ACC的磷酸化蛋白水平下降,GLUT4的蛋白量下調。
　　結論:乳鼠皮下注射MSG誘導MetS小鼠模型較好的模擬了人類MetS的病理生理特征。該模型的成模率接近100％,造模條件要求低,操作易掌握,且造模經(jīng)濟成本低,是一種較理想的MetS動物模型,可為抗代謝綜合征藥物的藥效學研究提供理想平臺。
　　第二部分PMQ抗代謝綜合征的藥理作用研究
　　目的:利用MSG小鼠模型評價PMQ是否具有改善代謝綜合征的作用。

6、r>　　方法:MSG小鼠和對照組Saline小鼠,于21天齡分籠,適應性喂養(yǎng)2周。第5周齡時,進行分組,每組動物數(shù)n=10:對照組Saline小鼠+溶劑組(Control);MSG小鼠+溶劑組(Vehicle);MSG小鼠+羅格列酮5mg/kg組(RSG5);MSG小鼠+PMQ5,10,20 mg/kg組(PMQ5,PMQ10,PMQ20)。采用灌胃給藥,每日1次。每周監(jiān)測各組小鼠的體重及攝食量。18周齡時,記錄各組小鼠體重、腰圍、體長

7、,取禁食血液分離血清,檢測各組小鼠的血清血糖、甘油三脂、總膽固醇、胰島素水平。后宰殺,分離相應組織器官,稱重、記錄,凍存?zhèn)錅y。
　　結果:PMQ各給藥組的小鼠的體重、腰圍、Lee指數(shù)以及脂肪含量與溶劑組比較,均出現(xiàn)不同程度的降低。其中,PMQ20mg/kg劑量組可使MSG小鼠的體重降至溶劑組的75％,腰圍降至溶劑組的89％,Lee指數(shù)降至溶劑組的92％,脂肪含量降至溶劑組的58％。差異均具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。結果表明,P

8、MQ對于MSG小鼠具有顯著的減肥作用。同時,PMQ可改善MSG小鼠的糖脂代謝紊亂。對于糖代謝,PMQ5、PMQ10、PMQ20劑量組可劑量依耐性地降低MSG小鼠的血糖水平(分別降至溶劑組的69％、64％、55％)。對于脂質代謝,PMQ各劑量組同樣能不同程度地降低MSG小鼠的血清甘油三酯及總膽固醇的水平。此外,PMQ還可以劑量依賴性地降低MSG小鼠的血清胰島素水平(PMQ5:65％,PMQ10:58％,PMQ20:39％ vs Vehic

9、le組),并顯著地改善MSG小鼠的胰島素抵抗,差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:五甲基槲皮素對于MSG小鼠可發(fā)揮較為全面的抗代謝綜合征作用。包括,改善肥胖、糖脂代謝紊亂以及胰島素抵抗。
　　第三部分PMQ抗代謝綜合征的作用機制研究
　　目的:在整體和細胞水平初步探討PMQ抗代謝綜合征的作用機制.
　　方法:C2C12肌原細胞生長至80％-90％滿時,換入誘導分化液(含2％馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)代替完全培養(yǎng)基

10、進行誘導分化,待C2C12肌原細胞分化成熟后,給予不同濃度PMQ(1,3,10μM)處理,作用24小時,MTT檢測C2C12成肌細胞的活力,葡萄糖消耗量試驗檢測C2C12成肌細胞的糖攝取能力;RT-PCR檢測C2C12成肌細胞脂肪酸氧化相關基因的mRNA表達;Western blot分別在整體和離體水平檢測MSG小鼠肌肉組織及C2C12成肌細胞的AMPK信號通路及GLUT4的蛋白表達。
　　結果:MTT實驗結果表明,PMQ1-10

11、μM濃度處理24h對C2C12成肌細胞的活力無明顯影響,表明,在此實驗劑量范圍內(1-10μM)PMQ對于 C2C12成肌細胞無毒性作用。葡萄糖消耗量結果表明:PMQ可劑量依賴性的增加C2C12成肌細胞的葡萄糖消耗量。PMQ1-10μM處理組可使 C2C12成肌細胞的葡萄糖消耗量增加19％—65％。RT-PCR檢測可知,PMQ可不同程度地增加 C2C12成肌細胞的脂肪酸氧化相關基因 mRNA表達。這些基因包括:過氧化物酶體增殖活化受體γ

12、輔助活化因子1α(PGC-1α)、過氧化物酶體增殖活化受體α(PPARα)、中鏈?；o酶脫氫酶(MCAD)、?；o酶A氧化酶(ACO)、肉堿棕櫚酰轉移酶-1b(CPT-1b)。Western blot結果表明:PMQ可在整體(MSG小鼠肌肉)和細胞水平(C2C12成肌細胞)上劑量依賴性地增加AMPK和ACC的磷酸化蛋白水平,同時可上調GLUT4的蛋白表達量。時程依賴性實驗結果表明,PMQ對于C2C12成肌細胞AMPK的激活作用至少能維持