五甲基槲皮素促進(jìn)白色脂肪棕色-米色化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、基于對(duì)脂肪可塑性的深入了解，促進(jìn)白色脂肪棕色/米色化已被認(rèn)為是治療肥胖及相關(guān)疾病的有希望的研究方向，相關(guān)領(lǐng)域的藥物研發(fā)備受關(guān)注。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）屬于天然多甲氧基黃酮類化合物中的一員，主要存在于沙棘果實(shí)和山柰屬植物根莖等天然植物中，受資源限制，研究甚少。本實(shí)驗(yàn)室采取半合成的方法，對(duì)槲皮素進(jìn)行全甲基化修飾得到PMQ，從而解決了藥源瓶頸問(wèn)題。PMQ已被證實(shí)具有抗代謝綜合征、抗糖尿病、抗心肌肥厚及

2、抗血栓形成等藥理活性。我們之前雖已證明PMQ具有誘導(dǎo)白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)變的作用，但其機(jī)制有待深入研究。本研究采用谷氨酸鈉誘導(dǎo)的肥胖（Monosodium glutamate-induced obesity,MSGIO）小鼠模型及3T3-L1脂肪細(xì)胞模型，在整體和細(xì)胞水平進(jìn)一步探討PMQ促進(jìn)白色脂肪棕色/米色化的作用和機(jī)制。
　　第一部分：PMQ促進(jìn)MSGIO小鼠白色脂肪棕色/米色化
　　目的：研究PMQ對(duì)MSGIO小鼠白色

3、脂肪棕色/米色化作用。
　　方法：制備MSGIO小鼠模型，5周齡時(shí)，隨機(jī)分為Control組、MSGIO組、PMQ各劑量組（5、10、20mg/kg/d），共5組，各組小鼠灌胃給藥，每日一次，第22周齡時(shí)進(jìn)行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）。24周齡時(shí)，測(cè)量各組小鼠體重、腰圍、體長(zhǎng)，經(jīng)眼眶靜脈叢采血后宰殺小鼠，獲取相應(yīng)組織器官。檢測(cè)各組小鼠的血清葡萄糖、甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、胰島素水平并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）

4、；腹股溝脂肪行HE染色，免疫組化；通過(guò)RT-PCR法，檢測(cè)各組小鼠腹股溝脂肪棕色化基因及米色化基因表達(dá)；Western blot法檢測(cè)各組小鼠腹股溝脂肪UCP-1蛋白水平。
　　結(jié)果：(1)與Control組相比，MSGIO小鼠呈現(xiàn)明顯肥胖，體重、腰圍、Lee指數(shù)、脂肪總重及脂肪指數(shù)分別增加45％、29%、33%、282%和179%。MSGIO小鼠出現(xiàn)糖脂代謝異常，血糖、TG、TC分別升高51%、120%和96%。MSGIO小鼠出

5、現(xiàn)高胰島素血癥、胰島素抵抗及糖耐量受損，表現(xiàn)為血清胰島素升高3.3倍、胰島素抵抗指數(shù)升高5.6倍、OGTT曲線下面積（AUC）增加60%。上述結(jié)果確證MSGIO小鼠是典型的肥胖型2型糖尿病模型。(2)相比Control組，MSGIO小鼠腹股溝脂肪細(xì)胞體積明顯增加，多為大脂滴單房細(xì)胞，棕色化基因Ucp-1、Pgc-1α、Cidea和Cox-7a1mRNA表達(dá)分別下調(diào)46%、42%、34%和26%，米色化基因Cd137、Tbx-1和Tmem

6、26分別降低60%、49%和56%，UCP-1+脂肪細(xì)胞較少及UCP-1蛋白表達(dá)減少45%。結(jié)果提示肥胖型2型糖尿病導(dǎo)致白色脂肪組織的棕色/米色化潛能降低。(3)PMQ劑量依賴性降低MSGIO小鼠的體重、腰圍、Lee指數(shù)、脂肪總重及脂肪指數(shù)，其中PMQ20mg/kg組降低這些指標(biāo)分別為16%、8%、4%、20%和10%?？崭寡?、血清TG、TC、血清胰島素、HOMA-IR指數(shù)及AUC均劑量依賴性降低，PMQ20mg/kg可使這些指標(biāo)達(dá)到

7、或接近達(dá)到Control組水平。結(jié)果表明，PMQ的療效滿足減肥藥物的1級(jí)和2級(jí)終點(diǎn)要求。(4)與MSGIO小鼠相比，PMQ各給藥組降低腹股溝脂肪細(xì)胞體積，多為小脂滴多房細(xì)胞；PMQ可劑量依賴性升高腹股溝脂肪棕色化基因（Ucp-1、Pgc-1α、Cidea、Cox-7a1）和米色化基因（Cd137、Tbx-1、Tmem26）mRNA水平及UCP-1蛋白表達(dá)，20mg/kg可使全部指標(biāo)達(dá)到Control組水平。表明PMQ增加MSGIO小鼠腹

8、股溝脂肪棕色/米色化表型。
　　第二部分：PMQ誘導(dǎo)白色脂肪棕色/米色化機(jī)制研究
　　目的：在整體和細(xì)胞水平上研究PMQ誘導(dǎo)白色脂肪向棕色/米色脂肪轉(zhuǎn)變的作用機(jī)制。
　　方法:采用RT-PCR和Western blot法分析腓腸肌AMPK-PGC-1α-FNDC5表達(dá)及ELISA檢測(cè)血清鳶尾素（irisin）；PMQ（1、3、10μM）干預(yù)C2C12肌管細(xì)胞，Western blot及ELISA法分析AMPK-PGC-

9、1α-FNDC5蛋白表達(dá)和肌管細(xì)胞條件化培養(yǎng)基（MCM）中irisin水平；收集MCM-PMQ及Anti-FNDC5中和處理MCM-PMQ10（實(shí)驗(yàn)分組：MCM-Vehicle、MCM-PMQ1/3/10、MCM-PMQ10+anti-FNDC5），用以干預(yù)3T3-L1細(xì)胞，RT-PCR及Western blot法分別分析3T3-L1脂肪細(xì)胞棕色、米色化基因及UCP-1蛋白表達(dá)；采用RNA干擾抑制C2C12細(xì)胞PGC-1α基因，West

10、ern blot及ELISA法分析PMQ對(duì)PGC-1α-FNDC5表達(dá)、irisin水平及MCM對(duì)UCP-1表達(dá)影響；采用AMPK抑制劑（Compound C）處理細(xì)胞，Western blot法分析PMQ對(duì)AMPK-PGC-1α-FNDC5表達(dá)影響。
　　結(jié)果：(1)與Control組相比，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上，MSGIO小鼠腓腸肌FNDC5分別下調(diào)34%和45%，PGC-1α分別下調(diào)38%和34%。MSGIO小鼠血清iri

11、sin水平降低52%，腓腸肌P-AMPK/AMPK比值下調(diào)49%。提示在肥胖型2型糖尿病小鼠，腓腸肌AMPK-PGC-1α-FNDC5通路表達(dá)及血清irisin水平均明顯下調(diào)。(2)與MSGIO小鼠相比，PMQ劑量依賴性上調(diào)腓腸肌PGC-1α和FNDC5的mRNA和蛋白表達(dá)及血清irisin水平，同時(shí)PMQ還劑量依賴性增加MSGIO小鼠腓腸肌P-AMPK表達(dá)，PMQ20mg/kg完全矯正肥胖導(dǎo)致的AMPK-PGC-1α-FNDC5通路表

12、達(dá)下調(diào)及irisin水平降低，使其恢復(fù)至Control水平。表明PMQ可激活骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信號(hào)通路，刺激irisin分泌。(3)PMQ可濃度依賴性刺激C2C12肌管細(xì)胞FNDC5蛋白表達(dá)及irisin釋放。PMQ孵育后的MCM濃度依賴性上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞棕色化基因（Ucp-1、Pgc-1α、Cidea、Cox-7a1）和米色化基因（Cd137、Tbx-1、Tmem26）mRNA水平及UCP-1蛋白表達(dá)，用

13、Anti-FNDC5抗體處理MCM-PMQ10后，部分拮抗或完全取消MCM-PMQ10對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞棕色/米色因子的上調(diào)作用。表明PMQ通過(guò)FNDC5/irisin通路介導(dǎo)白色脂肪棕色/米色化作用。(4)PMQ可劑量依賴性上調(diào)C2C12肌管細(xì)胞PGC-1α蛋白表達(dá)；C2C12細(xì)胞PGC-1α沉默后，消除PMQ對(duì)PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)和irisin分泌的促進(jìn)作用，MCM-PMQ10上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞UCP-1蛋白表

14、達(dá)的作用被完全取消。表明PMQ通過(guò)上調(diào)PGC-1α/FNDC5/irisin，從而上調(diào)脂肪細(xì)胞UCP-1蛋白表達(dá)。(5)在C2C12肌管細(xì)胞上，PMQ劑量依賴性升高其p-AMPK水平；Compound C干預(yù)后，PMQ上調(diào)P-AMPK、PGC-1α和FNDC5蛋白表達(dá)的作用均被全部取消。表明PMQ通過(guò)激活A(yù)MPK上調(diào)PGC-1α-FNDC5信號(hào)通路。
　　結(jié)論：(1)在肥胖型2型糖尿病小鼠模型（MSGIO）白色脂肪組織的棕色/米色