火龍果對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及離體誘變篩選抗寒突變體研究.pdf

1、火龍果(Hylocereus undatus Britton&Rose)是仙人掌科多年生攀援性肉莖植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有一般植物少有的花青苷和植物白蛋白，以及豐富的維生素和水溶性膳食纖維，具有很高的營(yíng)養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)價(jià)值。溫度是影響火龍果發(fā)展的主要限制因素，有研究表明，火龍果抗寒力較差，溫度低于5℃時(shí)火龍果即可能受凍，而0℃是大多數(shù)栽培品種能忍受的最小閾值。貴州等南亞熱帶地區(qū)經(jīng)常遭遇極端天氣（低溫冷害、倒春寒等）的影響，栽培火龍

2、果容易發(fā)生嚴(yán)重冷害和凍害。本研究通過(guò)開展火龍果對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)等相關(guān)研究，并通過(guò)生物技術(shù)手段離體誘變篩選抗寒突變體，旨在為火龍果的抗寒生理機(jī)制、抗寒新品種選育及尋找提高抗寒性的新途徑提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)方案。其主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以野生火龍果量天尺(Hylocereus undatus Liangtianchi)和貴州主栽火龍果品種紫紅龍、晶紅龍、粉紅龍成年植株的1年生枝條為試材，測(cè)定不同溫度(6、4、2、0、-

3、2、-4和-6℃)處理12h后枝條的電解質(zhì)滲出率(REC)，應(yīng)用Logistic方程計(jì)算出半致死溫度(LT50)，并通過(guò)恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;在LT50下設(shè)置不同處理時(shí)間，測(cè)定可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量，并進(jìn)行抗寒性分析。結(jié)果表明:火龍果枝條的REC和細(xì)胞膜傷害率(MIP)均隨溫度降低呈“S”型上升，不同火龍果品種的LT50在0.347～-1.031℃之間;在LT50處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，枝條中的

4、可溶性糖、可溶性蛋白及MDA含量均呈逐漸增加的趨勢(shì)，而Pro則呈先上升后下降的趨勢(shì)。基于LT50及抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)分析，初步判斷火龍果抗寒力大小表現(xiàn)為量天尺＞晶紅龍＞粉紅龍＞紫紅龍，這與枝條的恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果及大田表現(xiàn)基本一致。
　　(2)以野生火龍果量天尺和貴州主栽火龍果品種紫紅龍、晶紅龍、粉紅龍的1年生扦插幼苗為試材，人工控溫進(jìn)行抗寒鍛煉、低溫冷害處理及恢復(fù)生長(zhǎng)，以未經(jīng)任何處理作對(duì)照，測(cè)定不同處理下幼苗的REC、可溶性糖、可

5、溶性蛋白、Pro和MDA含量的變化。結(jié)果表明，REC隨溫度降低逐漸增加，恢復(fù)生長(zhǎng)后REC與對(duì)照之間沒有顯著差別。幼苗中的可溶性糖、可溶性蛋白、Pro及MDA含量在抗寒鍛煉和低溫處理后升高，恢復(fù)生長(zhǎng)后又降低。不同處理的可溶性糖和Pro含量變幅較大，MDA和可溶性蛋白含量變幅較小。運(yùn)用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)，得出火龍果扦插幼苗的抗寒性強(qiáng)弱表現(xiàn)為量天尺＞晶紅龍＞粉紅龍＞紫紅龍，這與幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果基本一致，也與成年

6、火龍果植株的抗寒性鑒定結(jié)果相同。
　　(3)以成年火龍果植株的莖段作為外植體，通過(guò)愈傷組織分化成功再生出完整植株。重點(diǎn)研究了外植體表面滅菌方法、不同取樣時(shí)間及取樣部位、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及配比、培養(yǎng)條件等對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的影響。結(jié)果表明，適宜幼嫩莖段表面滅菌的方式為75％的酒精消毒30 s+0.1％的升汞消毒6-8 min，適宜成熟莖段表面滅菌的方式為75％的酒精消毒30 s+0.1％的升汞消毒12-15 min;以

7、春季萌發(fā)的長(zhǎng)10-20 cm枝條誘導(dǎo)愈傷組織效果較好，最適愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.4 mg/L+KT0.8 mg/L，暗培養(yǎng)7d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織為黃綠色、致密狀，外表有顆粒狀突起。愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS+TDZ0.4 mg/L+KT(或ZT)0.8 mg/L效果較好，增殖系數(shù)達(dá)到8倍以上。在愈傷組織分化過(guò)程中，添加20-30％的椰子水對(duì)不定芽的形成具有一定的促進(jìn)作用，但總體上愈傷分化率較低。
　　(4)以

8、紫紅龍成年植株的莖段作為外植體，直接誘導(dǎo)不定芽再進(jìn)行增殖培養(yǎng)。結(jié)果表明，保留刺座上小刺和絨毛的莖段，其不定芽的誘導(dǎo)率顯著高于拔掉刺座上小刺和絨毛的莖段，而不帶刺座的外植體不定芽誘導(dǎo)率為0。不定芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1-0.2 mg/L，而適宜不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1-0.2 mg/L+Tryptone750 mg/L。
　　(5)以從紫紅龍成年植株莖

9、段直接培養(yǎng)的無(wú)菌苗作為外植體，篩選出適宜火龍果芽苗莖段愈傷誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.4 mg/L+2，4-D1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到89.1％，且質(zhì)量較好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到94.0％。而最適芽苗生根的培養(yǎng)基為6-BA1.0 mg/L+NAA0.1-0.2 mg/L+CCC0.5-1.0mg/L+AC0.03-0.05％，生根率達(dá)到98％以上;火龍果無(wú)菌苗的移栽成活率較高，用珍珠巖+腐殖土(

10、2∶1)和蛭石+腐殖土(1∶1)移栽火龍果無(wú)菌苗成活率均達(dá)到100％，且幼苗長(zhǎng)勢(shì)較好。
　　(6)以無(wú)菌條件下培養(yǎng)的單株紫紅龍幼苗為試材，研究了EMS和60Coγ輻照處理及HYP選擇壓對(duì)芽苗成活及生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，將叢生芽切割成單株幼苗后繼代培養(yǎng)15-30 d再對(duì)其進(jìn)行EMS處理具有較好的適應(yīng)性，以半致死濃度(LC50)和臨界致死濃度(LC40)確定適宜火龍果無(wú)菌苗EMS誘變的濃度為3.71-3.95％，處理時(shí)間為8.26-9

11、.32 h。低輻照強(qiáng)度(≤15Gy)對(duì)無(wú)菌苗的成活及分化無(wú)明顯影響，隨輻射劑量增大，無(wú)菌苗的成活率和分化率顯著降低，且對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用越明顯。以半致死劑量(LD50)和臨界致死劑量(LD40)確定火龍果無(wú)菌苗輻照的適宜劑量范圍為38.5-42.4 Gy?；瘕埞麩o(wú)菌苗本身能忍受一定濃度(≤8 mmol/L)的HYP，而經(jīng)EMS誘變處理過(guò)的無(wú)菌苗，在高濃度(20 mmol/L) HYP下的成活率顯著高于未經(jīng)EMS處理的對(duì)照植株。
　

12、　(7)無(wú)論經(jīng)過(guò)EMS或60Coγ誘變與否，火龍果無(wú)菌苗的REC和MDA含量均隨溫度降低而明顯增加，而葉綠素和類胡蘿卜素含量則隨溫度降低明顯降低，且溫度越低、持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，增加和降低的幅度越大。低溫對(duì)無(wú)菌苗的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響較大，特別是可溶性蛋白含量對(duì)溫度的變化更為敏感。各種抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性隨溫度降低和處理時(shí)間延長(zhǎng)變化規(guī)律不盡一致，但大多數(shù)酶活性在突然遭遇低溫的初期都有一個(gè)顯著

13、上升的過(guò)程，但隨溫度繼續(xù)下降或低溫時(shí)間延長(zhǎng)酶活性又逐漸降低。
　　(8)通過(guò)抗寒生理初步檢測(cè)，經(jīng)EMS或60Coγ輻照處理，并通過(guò)HYP篩選后的火龍果無(wú)菌苗在不同低溫和同一低溫不同處理時(shí)間下均表現(xiàn)出比對(duì)照更強(qiáng)的抗寒能力，這可能與誘變處理后植物細(xì)胞產(chǎn)生了一定的抗寒突變體有關(guān)。
　　(9)以EMS誘變初步篩選出的突變體材料10份和60Coγ輻照誘變初步篩選出的突變體材料4份進(jìn)行REC和Pro檢測(cè)及ISSR分析，以未經(jīng)任何處理的材

14、料作對(duì)照。結(jié)果表明，突變體的REC值較對(duì)照均有所降低，其中，5號(hào)突變體的REC較對(duì)照降幅最大。突變體中的Pro含量均顯著高于對(duì)照。其中，5號(hào)突變體的Pro含量是對(duì)照的6.5倍，這與同一材料的REC鑒定結(jié)果一致，說(shuō)明其抗寒力最強(qiáng)。利用篩選出9條ISSR引物對(duì)15份火龍果材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到67條譜帶，其中多態(tài)性帶的比例為71.64％，說(shuō)明供試材料的變異較為豐富。引物M06檢測(cè)出5號(hào)突變體有一條特異譜帶。采用NTSYS pc2.1軟件分析得出