偏硅酸鈉對(duì)高血脂家兔外周血白細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響.pdf

1、目的：以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)偏硅酸鈉(Na2SiO3)具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的作用，本文觀察Na2SiO3對(duì)ox-LDL刺激的健康家兔外周血白細(xì)胞以及高脂血癥家兔白細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響，為Na2SiO3抗AS機(jī)制提供進(jìn)一步資料。
　　 方法：
　　 第一部分
　　 1、低密度脂蛋白的分離、氧化和鑒定
　　 采用化學(xué)沉淀法提取低密度脂蛋白(LDL)。將LDL置于10μmol/LCuSO4溶液中，37℃避光氧

2、化24h，經(jīng)PH7.4PBS透析24h，過濾除菌，得ox-LDL，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濃度。
　　 2、白細(xì)胞懸液的制備及分組
　　 抽取健康家兔外周血，加入到事先準(zhǔn)備好的3.8％的枸櫞酸鈉中（兩者體積比為9:1），混勻得抗凝血。加入等體積的Hank's液，混勻備用。另取玻璃試管，各加入2倍于血體積的淋巴細(xì)胞分離液。將上述混合液緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘。血細(xì)胞被分成4

3、層，小心取出單個(gè)核細(xì)胞層和中性粒細(xì)胞層，混勻即得白細(xì)胞懸液。加五倍于白細(xì)胞懸液的Hank's液，充分混勻后，以2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。吸去上清液，沉淀洗2次即得所需白細(xì)胞。得到的細(xì)胞經(jīng)瑞士染色檢測(cè)白細(xì)胞純度95％以上，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率95％以上。分別設(shè)正常對(duì)照組、ox-LDL組、68.5mg組、34.2mg組、17.1mg組、8.5mg組。
　　 第二部分
　　 1、動(dòng)物分組：12只健康雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分

4、為對(duì)照組，高脂組，Na2SiO3組。
　　 2、指標(biāo)檢測(cè)：分離外周血白細(xì)胞后檢測(cè)加或不加刺激物條件下的ROS。掃描電鏡觀察各組白細(xì)胞形態(tài)變化。提取白細(xì)胞總RNA，運(yùn)用RT-PCR的方法，檢測(cè)CD36，TLR4，TLR2及gp91phoxmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分
　　 1、LDL的提取和氧化結(jié)果
　　 化學(xué)沉淀法所得LDL的瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，與正常血清中LDL條帶處

5、于同一水平。LDL氧化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，泳動(dòng)速率較LDL快近一倍，提示LDL的提取及氧化成功。
　　 2、Na2SiO3對(duì)ox-LDL刺激白細(xì)胞ROS的影響
　　 單純加Na2SiO3對(duì)正常家兔外周血白細(xì)胞ROS的生成無(wú)顯著影響；ox-LDL組與正常對(duì)照組相比ROS增多；8.5mg組與ox-LDL組相比白細(xì)胞ROS產(chǎn)生減少，其余三個(gè)Na2SiO3濃度組與ox-LDL組相比ROS無(wú)顯著差異。
　　

6、第二部分
　　 1、Na2SiO3對(duì)高脂組家兔外周血白細(xì)胞ROS的影響
　　 飼養(yǎng)動(dòng)物4周后，高脂組和Na2SiO3組血漿膽固醇均顯著高于對(duì)照組，但是兩組之間沒有顯著區(qū)別。高脂組白細(xì)胞ROS的生成量比正常對(duì)照組增加，Na2SiO3組比高脂組ROS生成量減少。
　　 2、白細(xì)胞掃描電鏡的觀察結(jié)果
　　 2.1正常對(duì)照組白細(xì)胞鏡下可見白細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)清晰、典型，背景干凈。粒細(xì)胞表面有光滑飽滿的大小不一的球狀突起

7、，且表面干凈，沒有物質(zhì)粘附。淋巴細(xì)胞表面有較低平的凹凸，無(wú)微絨毛；單核細(xì)胞，其表面有許多明顯的皺褶和不規(guī)則的突起。
　　 2.2高脂組白細(xì)胞鏡下可見白細(xì)胞表面被脂質(zhì)覆蓋，背景模糊不清，細(xì)胞體積縮小，明顯變形，表面結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞間粘附性增強(qiáng)。
　　 2.3 Na2SiO3組白細(xì)胞鏡下可見白細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)正常，背景干凈，細(xì)胞表面脂質(zhì)沉積少見，形狀飽滿，皺褶清晰，無(wú)粘附現(xiàn)象。并可見白細(xì)胞基底附著面形成多條錐形偽足伸向四周

8、。
　　 3、細(xì)胞CD36，TLR4，TLR2及gp91phoxmRNA變化
　　 高脂組單個(gè)核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞CD36、TLR4、TLR2和gp91phox的 mRNA均比對(duì)照組顯著增加，Na2SiO3組這四種基因的mRNA均顯著下調(diào)。
　　 結(jié)論：Na2SiO3對(duì)ox-LDL刺激健康家兔外周血白細(xì)胞產(chǎn)生ROS有抑制作用；飲用Na2SiO3可以下調(diào)高脂血癥家兔外周血單個(gè)核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞CD36、TLR4、TL