利用5-6腎切除模型探討透明質(zhì)酸在MSC歸巢過程中的作用.pdf

1、目的：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一種成體多能干細(xì)胞，具有自我復(fù)制和未分化的特點(diǎn)，在體外具有多向分化潛能，體內(nèi)能夠向損傷部位遷移并且分化成多種功能的細(xì)胞和組織器官，修復(fù)受損的心、腦、肺、腎等組織。MSC的歸巢是其發(fā)揮修復(fù)作用的關(guān)鍵的第一步，有研究發(fā)現(xiàn)在急性腎衰竭中，透明質(zhì)酸可以通過與其在MSC表面的受體CD44之間的結(jié)合促進(jìn)外源性MSC歸巢于受損腎臟?；诖搜芯?，我們推測在慢性腎衰竭過程中，也存在透明質(zhì)酸的表達(dá)異常，并且能夠

2、誘導(dǎo)MSC的歸巢，即通過透明質(zhì)酸和MSC表面受體CD44的相互作用來使趨化MSC歸巢于受損的腎臟組織，進(jìn)一步發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，本文擬從以下三個(gè)方面進(jìn)行研究:1、建立5/6腎切除大鼠腎小球硬化模型;觀察模型建立過程中各時(shí)間點(diǎn)透明質(zhì)酸的表達(dá)變化。2、5/6腎切除模型中MSC的歸巢與透明質(zhì)酸的關(guān)系。3、MSC延緩5/6腎切除殘腎纖維化的研究。
　　材料和方法：
　　第一部分:62只大鼠隨機(jī)分成兩組:假手術(shù)組17只（只進(jìn)行麻醉，手術(shù)

3、分離脂肪囊和腎被膜，不進(jìn)行腎臟切除），5/6腎切除組45只（二步法進(jìn)行5/6腎切除），繼續(xù)正常飲食，手術(shù)后2周，選取各組存活的大鼠（假手術(shù)組16只，5/6腎切除組35只）進(jìn)一步隨機(jī)等分為4wK組、8wK組、12wK組、16wK組、20wK組（即分別于術(shù)后第4、8、12、16、20周處死大鼠，其中模型組各組6-7只，假手術(shù)組各組3-4只）。處死大鼠后收集血標(biāo)本行血肌酐和尿素測定，留取殘腎組織，應(yīng)用HE、Masson染色觀察腎小球硬化指數(shù)和

4、腎間質(zhì)損傷指數(shù)的變化，應(yīng)用免疫組化、免疫印記來觀察不同第4、8、12、16、20周透明質(zhì)酸和TGF-β1的表達(dá)變化。
　　第二部分:培養(yǎng)購買的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株(MSC/GFP)，37℃和5％ CO2的恒溫箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞傳代2-3次，待細(xì)胞生長良好，在細(xì)胞融合達(dá)到70-80％時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。
　　將生長良好的MSC消化后調(diào)整濃度為104/ml，進(jìn)行體外遷移實(shí)驗(yàn)研究，即分別在Transwell的上

5、室加入MSC和BU75孵育后的MSC（BU75為CD44抗體，能夠阻斷CD44與透明質(zhì)酸的結(jié)合），分別在Transwell的下室加入含有0、100、200、300μg/ml透明質(zhì)酸的培養(yǎng)液，18小時(shí)后應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察濾膜背面的MSC的數(shù)量。
　　60只大鼠在經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成兩組:假手術(shù)組14只（只進(jìn)行麻醉，手術(shù)分離脂肪囊和腎被膜，不進(jìn)行腎臟切除），5/6腎切除組46只（二步法進(jìn)行5/6腎切除），繼續(xù)正常飲食，手術(shù)后

6、2周，選取各組存活的大鼠(5/6腎切除組35只、假手術(shù)組12只)進(jìn)一步隨機(jī)分為MSC組23只（4wI組、8wI組、12wI組、16wI組各5-6只:即分別于術(shù)后第4、8、12、16周尾靜脈注1毫升107個(gè)綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSC）和BU75組12只（8wI組、12wI組各6只:即分別于術(shù)后第8、12周尾靜脈注1毫升107個(gè)BU75孵育后的綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSC），以及假手術(shù)組12只（4wI組、8wI組、12wI組、16wI組各3只:即

7、假手術(shù)后第第4、8、12、16周尾靜脈注1毫升107個(gè)綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSC）。
　　注射MSC后4周處死大鼠，留取殘腎組織，應(yīng)用免疫熒光觀察MSC歸巢的數(shù)量和部位;應(yīng)用雙免疫熒光檢測歸巢后的MSC與透明質(zhì)酸的相關(guān)性。
　　第三部分:培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠MSC，37℃和5％ CO2的恒溫箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞傳代2-3次，待細(xì)胞生長良好，在細(xì)胞融合達(dá)到70-80％時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。
　　82只大鼠在經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)

8、一周后二步法進(jìn)行5/6腎切除（同論文一）:手術(shù)后2周，選取存活的大鼠隨機(jī)分成三組:模型組(n=26)、MSC治療組(n=23)和BU75組（n=12只），模型組和MSC治療組均進(jìn)一步等分為4wI組、8wI組、12wI組、16wI組（即分別于術(shù)后第4、8、12、16周尾靜脈注射1毫升生理鹽水或1毫升107MSC，其中各組均為5-6只）;BU75組進(jìn)一步等分為8wI組、12wI組（即分別于術(shù)后第8和12周尾靜脈注射1毫升BU75孵育30分鐘

9、的MSC，各組均為6只）。
　　尾靜脈注射后4周處死大鼠，留取血標(biāo)本和腎組織，觀察腎功能、腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù);應(yīng)用免疫組化、免疫印跡和Real-timePCR檢測殘腎組織中TGF-β和α-SMA蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分:
　　與假手術(shù)組相比，5/6腎切除術(shù)后第4周即開始出現(xiàn)腎功能異常(血肌酐70.43±3.83 vs49.33±2.03 umol/L)，腎功能進(jìn)行性

10、惡化，血肌酐第8周達(dá)到高峰（血肌酐103.33±7.35 vs45.33±7.06 umol/L），(P＜0.05)，第12周有所下降，第16周再次升高（血肌酐99.33±4.77 umol/L vs43.33±3.76），(P＜0.05)，并穩(wěn)定進(jìn)入慢性腎衰竭期。
　　殘腎組織從術(shù)后第4周開始即出現(xiàn)腎小球肥大、腎小管上皮細(xì)胞濁腫變性，第12周腎小球1/2面積出現(xiàn)局灶硬化，毛細(xì)血管袢玻璃樣變，間質(zhì)大部分腎小管萎縮，大量炎細(xì)胞浸潤;

11、第20周除上述改變外，間質(zhì)纖維化明顯加重。第4-20周腎小球硬化指數(shù)進(jìn)行性增高(假手術(shù)組:0.00±0.00-1.10±0.06;模型組:0.61±0.03-3.25±0.12，P＜0.05)和腎小管間質(zhì)間質(zhì)損傷指數(shù)同樣進(jìn)行性升高（假手術(shù)組:0.07±0.03-0.07±0.03;模型組:1.23±0.10-4.27±0.09），(P＜0.05)。
　　免疫組化結(jié)果:假手術(shù)組腎臟皮質(zhì)幾乎不表達(dá)透明質(zhì)酸，髓質(zhì)有部分表達(dá)，5/6腎切除

12、術(shù)后第4周即開始有透明質(zhì)酸的表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，腎小球系膜細(xì)胞胞漿、系膜區(qū)和腎間質(zhì)也有少量表達(dá);第4-20周表達(dá)逐漸增強(qiáng)（IOD值為7.06±0.29-30.33±0.98）;TGF-β1在假手術(shù)組無表達(dá)，5/6腎切除術(shù)后第4-20周表達(dá)逐漸增加，主要表達(dá)于腎小球系膜區(qū)、系膜細(xì)胞胞漿和腎間質(zhì)，后期明顯受損的腎小管上皮細(xì)胞胞漿也有較多的表達(dá)（IOD值為3.51±0.40-30.68±2.15）。免疫印記結(jié)果:透明質(zhì)酸和TG

13、F-β1在假手術(shù)組均無蛋白表達(dá)，5/6腎切除術(shù)后第4-20周透明質(zhì)酸和TGF-β1的蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與免疫組化結(jié)果一致(P＜0.05)。
　　5/6腎切除大鼠腎臟透明質(zhì)酸與血肌酐、TGF-β1、腎小球硬化指數(shù)及腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)均具有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為r1=0.556，r2=0.927，r3=0.934，r4=0.952(P＜0.01)。
　　第二部分:
　　與對照組相比，0-300μ g/ml的透明質(zhì)酸對MS

14、C的體外遷移能力有不同的影響，隨著透明質(zhì)酸濃度的增加，促進(jìn)MSC遷移的能力也增強(qiáng)，存在濃度依賴性，透明質(zhì)酸濃度超過200μg/ml以上不再存在濃度依賴性;應(yīng)用BU75阻斷透明質(zhì)酸和CD44的結(jié)合能力后，試驗(yàn)組的MSC的遷移能力明顯減弱。
　　5/6腎切除術(shù)后第4-16周尾靜脈注射MSC后均能夠歸巢于殘腎組織，主要定位于受損的腎小球、擴(kuò)張的腎小管和炎癥細(xì)胞浸潤的腎間質(zhì);第4-8周MSC注射組歸巢的MSC數(shù)量逐漸增加，5/6腎切除術(shù)后

15、第12-16周MSC注射組歸巢的MSC數(shù)量逐漸減少，熒光輝度值分析分別為4wI組(6.5±1.2)×103、8wI組(9.2±2.4)×103、12wI組(8.1±1.9)×103、16wI組(4.7±0.5)×103，組間相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);5/6腎切除術(shù)后第8、12周尾靜脈注射應(yīng)用CD44抗體中和后的MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別與第8、12周MSC注射組相比，歸巢的MSC數(shù)量減少，熒光輝度值分析分別為(7.3±1.5)×1

16、03和(6.6±1.1)×103，組間相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);透明質(zhì)酸和綠色熒光蛋白的雙熒光結(jié)果顯示歸巢的MSC主要定位于透明質(zhì)酸表達(dá)較多的區(qū)域:擴(kuò)張的腎小管上皮細(xì)胞、腎小管周圍和腎間質(zhì)。
　　第三部分:
　　5/6Nx術(shù)后第4、8周應(yīng)用MSC治療的大鼠腎功能較模型組改善（4wI組血肌酐85.67±3.81vs103.33±7.35 umol/L，P＜0.05;8wI組血肌酐80.00±4.44vs95.00±

17、4.68umol/L，P＜0.05)，但第12周、第16周應(yīng)用MSC后與模型組相比，腎功能無明顯改善(P＞0.05);于5/6Nx術(shù)后第8周和第12周尾靜脈注射應(yīng)用BU75孵育后的MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MSC組相比，對殘腎功能的影響無明顯差別(P＞0.05)。HE和Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎切除術(shù)后第4、8周應(yīng)用MSC治療的大鼠腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)較模型組改善(P＜0.05);第12、16周應(yīng)用MSC后對腎小球硬化指數(shù)和腎小

18、管間質(zhì)損傷指數(shù)無明顯改善(P＞0.05)，于5/6Nx術(shù)后第8周和第12周尾靜脈注射應(yīng)用BU75孵育后的MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MSC組相比，對殘腎病理改變的影響無明顯差別(P＞0.05)。
　　與模型組相比，第4、8、12、16周尾靜脈注射MSC4周后均能減少TGF-β1和α-SMA在腎小球系膜細(xì)胞胞漿、系膜區(qū)、腎小管上皮細(xì)胞胞漿以及腎間質(zhì)的陽性表達(dá)，治療后TGF-β1的IOD值分別為4.77±0.60、9.43±0.55、16.48

19、±0.93、20.92±1.33，各組與對應(yīng)模型組相比，TGF-β1表達(dá)均減少(P＜0.05);治療后α-SMA的IOD值分別為4.40±0.27、1143±0.36、13.08±0.56、20.08±1.48，分別與相對應(yīng)模型組α-SMA的IOD值相比(分別為6.23±0.26、15.87±0.49、19.93±1.11、27.22±1.38)均明顯減少，P＜0.05。免疫印記結(jié)果顯示，與模型組相比，第4、8、12、16周尾靜脈注射M

20、SC4周后均能減少TGF-β1和α-SMA的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05); RT-PCR結(jié)果顯示，與模型組相比，第4、8、12、16周尾靜脈注射MSC4周后均能減少TGF-β1和α-SMA的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)在5/6腎切除模型中透明質(zhì)酸表達(dá)逐漸增加，與腎小球硬化指數(shù)及腎間質(zhì)損傷指數(shù)及TGF-β1表達(dá)的存在正相關(guān)。
　　(2)外源性MSC能夠歸巢于受損的腎臟組織，主要定位于受損的腎

21、小球和腎小管，以及炎癥細(xì)胞浸潤的腎間質(zhì);5/6腎切除術(shù)后第4-8周MSC歸巢的數(shù)量與透明質(zhì)酸量呈正相關(guān)，大部分MSC的歸巢的部位與透明質(zhì)酸的表達(dá)位點(diǎn)相同;5/6腎切除術(shù)后第12-16周MSC歸巢的數(shù)量逐漸減少考慮與腎纖維化明顯導(dǎo)致MSC前進(jìn)受阻有關(guān)。
　　(3)5/6腎切除術(shù)后第4、8周應(yīng)用MSC治療后能夠改善受損的腎臟組織，表現(xiàn)為腎功能改善，腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化程度減輕，但第12、16周MSC后不能有效改善腎功能和阻止腎纖維

22、化的發(fā)展，與腎臟明顯纖維化導(dǎo)致MSC歸巢減少或局部微環(huán)境不利于MSC生存有關(guān);
　　(4)第4、8、12、16周應(yīng)用MSC后均能有效減少TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，MSC延緩腎纖維化的機(jī)制可能是通過旁分泌機(jī)制抑制TGF-β1的生成，抑制腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的聚集，最終達(dá)到延緩腎纖維化的發(fā)生;
　　(5)第12、16周應(yīng)用MSC后雖然沒有改善腎臟功能和腎臟病理改變，仍能有效減少TGF-β和α-SMA的表達(dá)