PEP-1-SOD1聯(lián)合銀杏葉提取物預(yù)處理對急性期腦梗死的保護(hù)作用.pdf

1、目的：研究細(xì)胞穿透肽(cellpenetratingpeptide，CPP)PEP-1介導(dǎo)銅，鋅—超氧化物歧化酶(Cu，Zn—superoxidedismutase，SOD1)在小鼠大腦皮質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力以及轉(zhuǎn)導(dǎo)的時間關(guān)系；研究單獨(dú)應(yīng)用PEP-1—SOD1融合蛋白預(yù)處理以及聯(lián)合應(yīng)用銀杏葉提取物(GinkoBilobaExtract，GBE)預(yù)處理時對小鼠腦梗死后神經(jīng)元的保護(hù)作用；探討其對神經(jīng)元凋亡的影響以及可能存在的保護(hù)機(jī)制。

2、方法： (1)取體質(zhì)量35～40g的雄性昆明小鼠隨機(jī)分成兩組(n=75)：SOD1組以及PEP-1—SOD1組。每組小鼠分別腹腔注射200ug的SOD1蛋白和PEP-1—SOD1融合蛋白，在1h、2h、4h、8h以及24h時間點(diǎn)取腦組織行相關(guān)指標(biāo)檢測：Wcsternblot測定外源性SOD1表達(dá)，免疫熒光化學(xué)法測定SOD1定位以及分布，黃嘌呤氧化酶法測定SOD1活性； (2)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、PEP-1—SO

3、D1組、GBE組以及聯(lián)合組(n=15)，建立永久性大腦中動脈閉塞(permanentmiddlecerebralarteryocclusion，PMCAO)模型。手術(shù)前30min，假手術(shù)組及模型組腹腔注射生理鹽水200ul，PEP-1—SOD1組注射PEP-1—SOD1融合蛋白200ug，GBE組注射舒血寧注射液35mg/kg，聯(lián)合組注射PEP-1—SOD1融合蛋白200ug以及舒血寧注射液35mg/kg。24h后取小鼠腦組織進(jìn)行相關(guān)指

4、標(biāo)檢測：①TTC染色測定梗死體積；②黃嘌呤氧化酶法測定SOD1活性，TBA法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；③末端脫氧核糖核酸酶轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT—mediateddUTPNick—EndLabeling，TUNEL)測定細(xì)胞凋亡；④免疫熒光化學(xué)法測定凋亡相關(guān)基因bax和bc1-2表達(dá)。 結(jié)果： (1)在SOD1和PEP-1—SOD1融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗中：①Westernbl

5、ot結(jié)果顯示藥后1h，PEP-1—SOD1組小鼠大腦皮質(zhì)在分子量約26KD處出現(xiàn)目的蛋白表達(dá)條帶，4h達(dá)高峰，24h仍有蛋白表達(dá)；而SOD1組的小鼠腦組織未能檢測到目的蛋白表達(dá)；②免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示PEP-1—SOD1組小鼠大腦皮質(zhì)給藥后1h出現(xiàn)特異性綠色熒光，4h時熒光最強(qiáng)，24h仍可見綠色熒光；而SOD1組小鼠大腦皮質(zhì)任何時間點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光；③SOD1活性檢測結(jié)果提示PEP-1—SOD1組小鼠大腦皮質(zhì)給藥后1hSOD1活性升高

6、，4h達(dá)高峰，24h時仍明顯高于SOD1組。結(jié)果證明PEP-1—SOD1融合蛋白可以轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入小鼠大腦皮質(zhì)，且轉(zhuǎn)導(dǎo)入腦組織的SOD1具有酶的活性；而單獨(dú)的SOD1則不能進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 (2)在對腦梗死后神經(jīng)元的保護(hù)作用實(shí)驗中：①TTC染色顯示PEP-1—SOD1組梗死體積縮小(P＜0.05vs模型組)，聯(lián)合組梗死體積則明顯縮小(P＜0.01vs模型組)，但PEP-1—SOD1組與聯(lián)合組之間未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；②SO

7、D1活性以及MDA含量檢測顯示腦梗死后24h模型組SOD1活性明顯下降，MDA含量升高(P＜0.01vs假手術(shù)組)；PEP-1—SOD1組以及聯(lián)合組SOD1活性升高，MDA含量下降(P＜0.01vs模型組)，但此二組之間未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；③腦梗死后24h，TUNEL染色顯示模型組凋亡細(xì)胞增多，bax表達(dá)陽性細(xì)胞較多而bc1-2陽性細(xì)胞表達(dá)較少(P＜0.01vs假手術(shù)組)；PEP-1—SOD1組凋亡細(xì)胞減少，bax表達(dá)陽性細(xì)

8、胞下降而bc1-2陽性細(xì)胞表達(dá)升高(P＜0.01vs模型組)；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡、bax表達(dá)陽性細(xì)胞進(jìn)一步減少，bc1-2表達(dá)陽性細(xì)胞進(jìn)一步增多(P＜0.05vsPEP-1—SOD1組)。 結(jié)論： (1)PEP-1可以介導(dǎo)SOD1以天然活性形式轉(zhuǎn)導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，單獨(dú)應(yīng)用SOD1不具備跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力； (2)PEP-1—SOD1融合蛋白預(yù)處理對梗死后神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。 (3)聯(lián)合應(yīng)用PEP-1—SOD1