化合物RY10-4部分作用機(jī)制及抗腫瘤活性的研究.pdf

1、本論文主要對(duì)新型特異性抗腫瘤化合物RY10-4的部分作用機(jī)制及其抗腫瘤活性進(jìn)行了研究,主要內(nèi)容分為兩部分:第一部分研究了RY10-4誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬性死亡的作用及其影響的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路,同時(shí)將RY10-4與原芹菜素在自噬缺陷的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活性的差異進(jìn)行了對(duì)比,探討RY10-4抗乳腺癌作用的潛在機(jī)制及其抗乳腺癌作用優(yōu)于原芹菜素的可能原因;第二部分主要研究了RY10-4體外和體內(nèi)抑制人肝癌HepG2細(xì)

2、胞增殖的作用,探討其體內(nèi)外抗肝癌的活性,并對(duì)其抗肝癌活性相關(guān)的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　第一部分:RY10-4誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7自噬性細(xì)胞死亡作用的研究
　　目的:鑒于原芹菜素類似物RY10-4表現(xiàn)出更好的體外抗腫瘤作用及較低的體內(nèi)不良反應(yīng),本部分探討其可能的作用機(jī)制。研究RY10-4誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬的活性,并與原芹菜素的作用進(jìn)行比較;另外,進(jìn)一步研究RY10-4誘導(dǎo)的自噬活性在抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的

3、作用以及相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　方法:通過免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3B蛋白的表達(dá)和分布、MDC染色法、WesternBlot法檢測(cè)LC3B和p62蛋白的表達(dá)以及電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的分析,綜合判斷RY10-4與原芹菜素是否誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬的發(fā)生;通過應(yīng)用自噬抑制劑和干擾自噬相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)RY10-4誘導(dǎo)的自噬活性在細(xì)胞死亡中的作用進(jìn)行研究;通過WesternBlot檢測(cè)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平研究RY10-4誘導(dǎo)自噬所

4、涉及的信號(hào)通路。
　　結(jié)果:RY10-4可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬的發(fā)生,而原芹菜素沒有這方面的作用;自噬抑制劑3-MA或干擾自噬相關(guān)基因ATG7的表達(dá)抑制細(xì)胞自噬活性后,RY10-4處理后細(xì)胞的存活率顯著提高;另外,RY10-4處理后細(xì)胞磷酸化mTOR和p70S6K的表達(dá)呈濃度依賴性的降低,磷酸化Akt的表達(dá)呈濃度和時(shí)間依賴的降低,而AMPK的活性基本無變化。
　　結(jié)論:RY10-4通過Akt/mTOR通路抑制mTOR信號(hào)而

5、誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的自噬,并作為一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的機(jī)制,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的死亡。
　　第二部分:RY10-4體外和體內(nèi)抗肝癌作用的研究
　　目的:研究RY10-4體外和體內(nèi)抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用,探討RY10-4體內(nèi)外抗肝癌的活性,并對(duì)其抗肝癌活性的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:通過SRB染色法、貼壁集落形成試驗(yàn)研究RY10-4抑制HepG2細(xì)胞體外增殖的作用;通過PI染色法流式細(xì)胞儀分析RY10

6、-4細(xì)胞周期阻滯作用;Hoechst33342熒光染色法、AnnexinV/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)RY10-4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行研究;應(yīng)用活性氧檢測(cè)試劑盒及線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒研究RY10-4誘導(dǎo)活性氧生成和線粒體膜電位的變化,并使用抗氧化劑NAC進(jìn)行驗(yàn)證;以人肝癌HepG2細(xì)胞裸小鼠異種移植瘤模型評(píng)價(jià)RY10-4的體內(nèi)抗肝癌活性。結(jié)果:RY10-4顯著抑制HepG2細(xì)胞體外的增殖活性,減少其體外的克隆形成率;RY10-4處理

7、后細(xì)胞的S期和G2/M期細(xì)胞比率明顯增加,出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征,凋亡細(xì)胞比率顯著增高;RY10-4可誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧的生成,降低線粒體膜電位,NAC能抑制RY10-4的上述作用;RY10-4顯著抑制荷瘤裸鼠HepG2移植瘤的生長(zhǎng),且對(duì)動(dòng)物的血液和肝腎功能無明顯影響。
　　結(jié)論:RY10-4具有良好的體外和體內(nèi)的抗肝癌活性,其可能的作用機(jī)制包括:RY10-4可以阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程;RY10-4通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS的生成,引起細(xì)