腹瀉仔豬Salmonella、Escherichia coli分離鑒定及生物膜與耐藥性和毒力關(guān)系研究.pdf

1、自2010年冬季以來(lái)，先后在我國(guó)包括安徽在內(nèi)的多個(gè)省份發(fā)生了大范圍的生豬腹瀉疫情，各種日齡的豬均有發(fā)生，其中以哺乳仔豬最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為發(fā)病急、發(fā)病率和死亡率高的特點(diǎn)。根據(jù)全國(guó)豬病持續(xù)監(jiān)測(cè)和調(diào)查結(jié)果，當(dāng)前造成生豬腹瀉流行的主要病原是豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，除此之外尚與豬輪狀病毒、博卡病毒、豬圓環(huán)病毒、沙門(mén)氏菌、致病性大腸桿菌等病原的存在有關(guān)。沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要細(xì)菌性病原菌。隨著獸醫(yī)臨床上抗生素的不合

2、理使用，致使沙門(mén)氏菌、大腸桿菌耐藥菌株的數(shù)量逐年上升，臨床用藥效果不明顯，而生物膜的形成則是細(xì)菌增強(qiáng)抵抗不良環(huán)境的結(jié)果，如對(duì)抗生素的敏感性、毒力的改變等。針對(duì)安徽地區(qū)的生豬腹瀉疫情，為制定有效的防控措施提供科學(xué)依據(jù)，我們分別從病毒性病原和細(xì)菌性病原兩個(gè)方面展開(kāi)了調(diào)查研究。圍繞沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌，本研究進(jìn)行了以下工作：
　　1、采用常規(guī)法結(jié)合PCR技術(shù)，對(duì)601份糞便和腸道內(nèi)容物樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌的分離鑒定；并利

3、用玻片凝集試驗(yàn)鑒定分離菌株的血清型。結(jié)果顯示，601份樣品中分離到沙門(mén)氏菌69株，陽(yáng)性檢出率為11.5％，致病性大腸桿菌129株，陽(yáng)性檢出率為21.5%。其中糞便樣品中沙門(mén)氏菌檢出率為13.1%，致病性大腸桿菌檢出率為7.5%；腸道內(nèi)容物樣品中沙門(mén)氏菌檢出率為8.8%，致病性大腸桿菌檢出率為44.7%。沙門(mén)氏菌血清型有德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、明斯特沙門(mén)氏菌、紐蘭沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌，其優(yōu)勢(shì)血清型為德?tīng)柋吧抽T(mén)

4、氏菌；致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O:55、O:26、O:125、O:128、O:6、O:111、O:15、O:7、O:104。
　　2、采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，對(duì)沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌分離株進(jìn)行23種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，69株沙門(mén)氏菌分離株對(duì)四環(huán)素和強(qiáng)力霉素的耐藥率高，分別為71.1%、69.6%，而對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢哌酮、亞胺培南、頭孢曲松均敏感；分離株耐7-10種抗生素的菌株

5、占10.1%(7/69)，耐11種抗生素的菌株占4.3%(3/69)，多重耐藥譜為四環(huán)素-強(qiáng)力霉素-阿莫西林-氨芐西林-甲氧芐啶-復(fù)方新諾明-氟苯尼考。129株致病性大腸桿菌分離株對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶的耐藥率高，分別為92.2%、92.2%、93%、90.7%、89.1%、87.6%，而對(duì)亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、頭孢吡肟的敏感率最高，分別為98.4%、88.4%、88.4%、86.

6、8%。分離株耐2-10種抗生素的菌株占31.0%(40/129)，耐11-20種抗生素的菌株占66.7%(86/129)，耐21種抗生素的菌株占0.8%(1/129)，多重耐藥譜為阿莫西林-氨芐西林-四環(huán)素-強(qiáng)力霉素-復(fù)方新諾明-甲氧芐啶-慶大霉素-環(huán)丙沙星。同時(shí)結(jié)合表型確證試驗(yàn)鑒定產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株，結(jié)果鑒定出沙門(mén)氏菌1株、致病性大腸桿菌38株。結(jié)果表明，沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌均具有較強(qiáng)的多重耐藥性，且致病性大腸

7、桿菌強(qiáng)于沙門(mén)氏菌。
　　3、采用96孔板法測(cè)定沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌分離株體外生物膜形成能力，將生物膜的形成能力分為強(qiáng)（3+）、中（2+）、弱（1+）和陰性（—）。結(jié)果顯示，沙門(mén)氏菌分離株生物膜陽(yáng)性率為92.8%(64/69)，其中3+占14.5%(10/69)、1+占78.3%(54/69)；致病性大腸桿菌分離株生物膜陽(yáng)性率為96.1%(124/129)，其中3+占14.7%(19/129)、2+占20.9%(27/129)、

8、1+占60.5%(78/129)。結(jié)果表明，沙門(mén)氏菌和致病性大腸桿菌分離株生物膜陽(yáng)性率高，生物膜形成均以1+為主。
　　4、選擇生物膜形成強(qiáng)的沙門(mén)氏菌3株和致病性大腸桿菌2株，共5株。采用微孔板法測(cè)定5株細(xì)菌的浮游細(xì)菌及生物膜細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、頭孢拉定的最小抑菌濃度（MIC），同時(shí)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌形成生物膜能力及對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)生物膜細(xì)菌的MIC。結(jié)果顯示，5株生物膜細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星的MIC較浮游細(xì)菌提高2~16倍，對(duì)

9、氟苯尼考的MIC較浮游細(xì)菌提高8~16倍，而對(duì)強(qiáng)力霉素和頭孢拉定的MIC兩者則無(wú)差異。5株細(xì)菌在不同時(shí)間點(diǎn)形成生物膜的能力不同，生物膜形成3+時(shí)對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考的MIC最大。結(jié)果表明，5株細(xì)菌在形成生物膜后對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考的耐藥性增強(qiáng)。
　　5、選擇8株生物膜形成強(qiáng)3+（3株）、弱1+（3株）、陰性—（2株）的沙門(mén)氏菌和8株生物膜形成強(qiáng)3+（2株）、中2+（2株）、弱1+（2株）、陰性—（2株）的致病性大腸桿菌，采用寇氏改

10、良法測(cè)定對(duì)昆明小鼠的半數(shù)致死量（LD50），并利用SAS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，沙門(mén)氏菌生物膜形成3+的LD50分別為2.44×109CFU/mL、8.75×106 CFU/mL、2.80×107 CFU/mL；1+的LD50分別為1.19×107 CFU/mL、1.85×107 CFU/mL、4.77×107 CFU/mL；—的LD50分別為1.50×107 CFU/mL、3.08×107 CFU/mL；致病性大腸桿菌生物膜形成

11、3+的LD50分別為9.59×108 CFU/mL、6.87×108 CFU/mL；2+的LD50分別為2.30×108 CFU/mL、4.64×108 CFU/mL；1+的LD50分別為3.34×107 CFU/mL、7.32×107 CFU/mL；—的LD50分別為1.20×107 CFU/mL、2.75×107 CFU/mL。沙門(mén)氏菌生物膜形成3+與1+、—細(xì)菌毒力差異顯著（P<0.05）；致病性大腸桿菌生物膜形成3+與1+、—細(xì)