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文檔簡介
1、研究背景及目的:二惡英(Dioxin)是一類氯代含氧三環(huán)芳烴類化合物的統(tǒng)稱,它是環(huán)境中一類毒性極強的污染物。二惡英的來源有多個途徑:城市生活垃圾、工業(yè)廢物、醫(yī)院廢棄物的焚燒;殺蟲劑、除草劑、防腐劑和油漆添加劑等一些工業(yè)生產中所產生的副產品;此外,紙漿漂白、森林火災、火山爆發(fā)、汽車尾氣的排放、吸煙等都會產生二惡英。二惡英的接觸方式主要是職業(yè)接觸和日常生活接觸,從事殺蟲劑、除草劑、防腐劑和油漆添加劑生產、垃圾焚燒、紙漿漂白等職業(yè)人群在工作的
2、過程中可以接觸二惡英;日常生活中,一些動物性食品如家畜、家禽及其肉、蛋、奶,魚類等水產品易受到二惡英污染,二惡英通過食物鏈在人和動物體內蓄積,沉積在脂肪組織或臟器中。二惡英對人體的毒性主要表現(xiàn)為生殖毒性、免疫毒性、皮膚毒性和致癌性。由于二惡英脂溶性高,半衰期長,不易分解排出,因此它對人類健康危害不容忽視。 2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是該類物
3、質中致癌作用最強的一種,被認為是世界上毒性最強的化合物,已被列為人類Ⅰ類致癌物。TCDD對人和動物的致癌性研究己成為當前的一個熱點,眾多動物實驗和人群隊列研究證明TCDD可致肺、肝、軟組織、皮膚、甲狀腺等多器官組織發(fā)生腫瘤,其中肺癌是TCDD引起的一類最常見的腫瘤,但其致癌機理仍然不清楚。隨著分子生物學和分子遺傳學的研究進展,人們越來越認識到細胞周期調節(jié)失控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。在哺乳動物細胞周期中,G1/S期之間的調控點是細胞內
4、外信號傳遞、細胞增殖調控的關鍵點,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展常與該調控點調節(jié)異常密切相關。而由P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因組成的調控途徑(E2F-1/Rb通路)與G1/S調控點的關系最為密切。因此,我們假設:E2F-1/Rb通路相關基因的異常可能會參與二惡英致肺癌變的有關機理。本課題擬建立二惡英致大鼠肺癌動物模型,運用熒光免疫組織化學和分子生物學手段檢測大鼠肺組織P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因的表達情況,探討這些
5、基因的異常表達在二惡英致大鼠肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。 方法:1.建立二惡英致大鼠肺癌動物模型。將40只初斷乳SD大鼠分為二惡英染毒組(20只)和對照組(20只),雌雄各半,飼養(yǎng)觀察二周后開始染毒。將TCDD溶于DMSO配制成濃度為125ng/ml,按0.58ng/g.BW劑量對染毒組大鼠進行腹腔注射,每周染毒一次,對照組予以等體積DMSO溶劑腹腔注射。染毒6個月,染毒組和對照組分別于第2個月、3個月、4.5個月、6個月各處死5
6、只大鼠,取其肺組織,一部分液氮凍存,一部分浸泡于10%中性甲醛,制成石蠟切片待用。 2.病理診斷:對石蠟切片進行HE染色,顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理變化。由病理學專家進行病理診斷。 3.用免疫熒光組織化學技術檢測各組大鼠肺組織中P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因的蛋白表達情況。同時設陽性對照和陰性對照進行結果分析。 4.用RT-PCR檢測大鼠肺組織中P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因
7、mRNA表達。 5.統(tǒng)計分析,用SPSSforwindows11.0軟件進行方差分析和卡方檢驗。 結果:1.成功建立了二惡英致大鼠肺癌模型。病理檢查顯示染毒組20只大鼠中正常5例,增生5例,異型增生6例,肺癌4例(包括1例小細胞肺癌,1例透明細胞癌,2例腺癌)。正常對照組20例中18例正常,2例輕度增生。并根據(jù)病理結果將TCDD染毒大鼠分為正常、增生、異型增生、肺癌四個組。 2.熒光免疫組織化學及PT-PCR檢測
8、P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因的表達,結果顯示: 2.1與對照組相比,TCDD染毒組中P16的蛋白表達顯著降低,P<0.05;在TCDD染毒組中,隨著病變程度加重,P16的表達水平存在下降趨勢。PT-PCR檢測結果與熒光免疫組化法檢測結果一致。 2.2與對照組相比,TCDD染毒組中CyclinD1的蛋白表達均升高,具有顯著性差異(P<0.05);在TCDD染毒組中,隨著病變程度加重,其表達水平逐漸升高,各
9、組間兩兩比較均有差異顯著性(均有P<0.05),PT-PCR檢測結果與熒光免疫組化法檢測結果一致。 2.3與對照組相比,TCDD染毒組中Rb的蛋白表達均降低,具有顯著性差異(P<0.05);在TCDD染毒組中,隨著病變程度加重,其表達水平逐漸降低,但在TCDD染毒大鼠正常組與增生組、增生組與異型增生組差異無顯著性(P>0.05,P>0.05),它們與肺癌組相比差異均有顯著性意義(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。PT-
10、PCR檢測結果與熒光免疫組化法檢測結果一致。 2.4與對照組相比,TCDD染毒組中E2F-1的蛋白表達明顯升高,P<0.05;在TCDD染毒組中,隨著病變程度加重,其表達水平逐漸升高,各組間兩兩比較均有差異顯著性(均有P<0.05),PT-PCR檢測結果與熒光免疫組化法檢測結果一致。 結論:1.大鼠長期暴露于二惡英,可導致肺癌發(fā)生,以腺癌為主。其癌變過程中可見肺組織增生、異型增生、癌等不同程度病變。表明二惡英(TCDD)
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