基于毛細(xì)管電色譜技術(shù)的藥物復(fù)雜體系分離分析方法研究.pdf

1、復(fù)雜藥物體系分析包括了植物藥有效成分的分析和生物樣品中的藥物及代謝產(chǎn)物的分析等。其主要特點(diǎn)有：（1）成分或基質(zhì)復(fù)雜。一種植物藥可能就含有上百種化學(xué)成分；而在生物樣品中，許多內(nèi)源性物質(zhì)的存在往往很容易干擾到樣品的準(zhǔn)確定量分析。（2）生物樣品的分析中，多數(shù)情況下是微量甚至痕量的。因此，發(fā)展高效、高選擇性、高靈敏度的分析方法成為分析工作中的重要研究?jī)?nèi)容。
　　 毛細(xì)管電色譜是一種在毛細(xì)管電泳技術(shù)的不斷發(fā)展和高效液相色譜技術(shù)與理論日益完

2、善的基礎(chǔ)上逐步興起的以電遷移原理和色譜分離原理相結(jié)合的新型分離分析技術(shù)，它結(jié)合了毛細(xì)管電泳的高效性和毛細(xì)管液相色譜的高選擇性，是目前微分離分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　 毛細(xì)管電色譜的分離結(jié)合電泳作用力和色譜分配作用兩種分離機(jī)制，通過溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異實(shí)現(xiàn)，具有快速、靈敏、樣品和溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。
　　 根據(jù)分離過程中驅(qū)動(dòng)力的不同可以將毛細(xì)管電色譜分為電滲流驅(qū)動(dòng)型和壓力電滲流雙重

3、驅(qū)動(dòng)型電色譜兩種技術(shù)。電滲流驅(qū)動(dòng)型毛細(xì)管電色譜以電滲流為驅(qū)動(dòng)力，使樣品區(qū)帶保持平塞型流型，因此柱效好，靈敏度高；壓力驅(qū)動(dòng)型電色譜即加壓毛細(xì)管電色譜，在使用電滲流的同時(shí)使用壓力作為驅(qū)動(dòng)力，這樣可以加快分析速度，便于梯度洗脫，減小在使用填充柱時(shí)由于柱塞引起的氣泡問題。
　　 毛細(xì)管電色譜柱在毛細(xì)管電色譜分離體系中占據(jù)最重要的地位，它具有雙重作用：一是作為固定相，承擔(dān)對(duì)對(duì)象的分離任務(wù)；二是在其表面形成雙電層，在電場(chǎng)作用下產(chǎn)生EOF作為

4、驅(qū)動(dòng)力。根據(jù)固定相的材質(zhì)以及制備方法的不同，毛細(xì)管電色譜柱分為毛細(xì)管開管柱、毛細(xì)管填充柱和毛細(xì)管整體柱。
　　 毛細(xì)管開管柱主要通過涂布、鍵合和溶膠一凝膠等方法在柱內(nèi)壁制備薄層固相，使溶質(zhì)在依靠電泳淌度的差異進(jìn)行分離的基礎(chǔ)上，輔以一定的色譜分離機(jī)理，所以制備關(guān)鍵是如何通過增大表面積來增大柱容量。開管柱的優(yōu)點(diǎn)是柱效高，但相對(duì)于填充柱和整體柱，其相比低、柱容量小且重現(xiàn)性較差。
　　 將色譜用顆粒固定相裝填入毛細(xì)空管而成的毛細(xì)

5、管填充柱，目前技術(shù)最為成熟且已經(jīng)商品化，可以說是高效液相色譜柱的一種微型化應(yīng)用。這種柱技術(shù)繼承了傳統(tǒng)液相色譜柱選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，又解決了開管柱相比低、柱容量小、重現(xiàn)性較差的問題。但是由于柱填充和柱塞的制備工藝對(duì)操作者要求比較高，且柱塞的存在增大了氣泡產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)和柱折斷的概率；另外，由于使用鍵合硅膠作為固定相，使流動(dòng)相的pH范圍只能選擇在2～8之間，這些缺點(diǎn)使毛細(xì)管填充柱的應(yīng)用受到了一定的限制。
　　 與毛細(xì)管填充柱不同的是，毛細(xì)管

6、整體柱由聚合液在毛細(xì)管內(nèi)原位聚合而成，無須制備柱塞，柱長(zhǎng)也可方便地加以控制，可根據(jù)基體及表面官能團(tuán)的需要選用不同的有機(jī)單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，也可通過對(duì)參加反應(yīng)的單體或不參與反應(yīng)的致孔劑比率加以調(diào)控而靈活地控制聚合物的孔隙率等參數(shù)。具有制備方法簡(jiǎn)單，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，通透性、重現(xiàn)性好，柱效高，固定相表面易于改性，無需制備柱塞和可進(jìn)行快速分離等優(yōu)點(diǎn)，近幾年發(fā)展迅速，被廣泛地應(yīng)用于各種酸性、堿性及中性小分子、核酸、氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)大分子生物樣品、

7、食品樣品及環(huán)境樣本等復(fù)雜微量體系的分離分析。根據(jù)所制備的整體材料的不同，整體柱分為有機(jī)聚合物整體柱、無機(jī)聚合物整體柱和顆粒固定化整體柱。其中有機(jī)聚合物整體柱的制備方法是將單體混合物（功能單體、交聯(lián)劑以及電滲流產(chǎn)生劑）、致孔劑混合物（通常為二元或三元致孔劑）和引發(fā)劑的混合溶液加入空管柱中通過熱引發(fā)或光引發(fā)聚合。反應(yīng)完全后用有機(jī)溶劑和水除去致孔劑及其它未反應(yīng)化合物即可。但是毛細(xì)管整體柱也存在一些問題：這種柱制備技術(shù)是近二十年才逐漸發(fā)展起來的

8、新興柱技術(shù)，因此在很多方面還只是處于研究探索階段，就本課題所研究的甲基丙烯酸酯類整體柱而言，目前制備技術(shù)較為成熟的為引入短鏈功能單體的甲基丙烯酸丁酯整體柱，這種整體柱中的功能基團(tuán)為四個(gè)碳的烷鏈，在相同條件下，選擇性勢(shì)必弱于以O(shè)DS為填充固定相的毛細(xì)管填充柱。若沒有合理的控制各聚合液成分的配比的情況下引入長(zhǎng)鏈功能單體，柱效反而不如短烷鏈的整體柱。
　　 綜上所述，毛細(xì)管填充柱以及毛細(xì)管整體柱也各有其優(yōu)缺點(diǎn)，不同驅(qū)動(dòng)模式的毛細(xì)管電色

9、譜具有不同的特點(diǎn)和使用范圍。
　　 本課題對(duì)這兩種毛細(xì)管柱在上述提及的兩種不同毛細(xì)管電色譜技術(shù)上的應(yīng)用進(jìn)行了考察，對(duì)其適用性進(jìn)行探討和研究。研究表明pCEC是一種以壓力為主要驅(qū)動(dòng)力，EOF為次要驅(qū)動(dòng)力的電色譜技術(shù)，或可稱之為電壓輔助的微徑液相技術(shù)，某種意義上來說，類似于傳統(tǒng)液相柱的毛細(xì)管填充柱由于優(yōu)越的選擇性與其更為匹配；另一方面，主要使用壓力作為主要驅(qū)動(dòng)力的pCEC又可以有效地抑制毛細(xì)管填充柱易產(chǎn)生氣泡的問題，同時(shí)，采用梯度洗

10、脫的手段可以更加快速有效的進(jìn)行復(fù)雜樣品的分離。綜上我們認(rèn)為使用毛細(xì)管填充柱的pCEC技術(shù)在分離分析復(fù)雜樣品上，具有優(yōu)越表現(xiàn)，如中藥指紋圖譜的建立。毛細(xì)管整體柱由于沒有柱塞，避免了填充柱中相不均勻性造成的氣泡問題，更為適用于基本上只有EOF作為驅(qū)動(dòng)力的常規(guī)CEC技術(shù)，且毛細(xì)管整體柱通透性更好，所以可以實(shí)現(xiàn)柱效更高的快速分離分析，如中藥主要有效成分的質(zhì)量控制以及生物體內(nèi)樣品的分析。
　　 具體研究工作包括：
　　 1.南北五

11、味子所含木脂素的種類及其含量的差別較大，但市場(chǎng)流通中二者混用現(xiàn)象較為普遍，因此利用pCEC等度技術(shù)和自制毛細(xì)管填充柱，以五味子中七種木脂素作為特征成分，并對(duì)其中五種進(jìn)行分離分析和含量測(cè)定，達(dá)到質(zhì)量控制的目的。
　　 2.針對(duì)等度洗脫復(fù)雜樣品耗時(shí)較長(zhǎng)的問題，進(jìn)一步運(yùn)用pCEC梯度洗脫技術(shù)，成功分離銀杏葉提取物中多種黃酮醇苷類成分，完成其指紋譜的初步建立。在此基礎(chǔ)上，將商品化毛細(xì)管填充柱和自制毛細(xì)管有機(jī)聚合物整體柱同時(shí)運(yùn)用于此技術(shù)，

12、對(duì)其分離機(jī)理和性能進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)在pCEC模式下，以O(shè)DS為填料的毛細(xì)管填充柱在分離效果和選擇性上優(yōu)于以甲基丙烯酸丁酯作為功能單體的甲基丙烯酸酯類整體柱，說明相較于甲基丙烯酸酯類整體柱，填充柱與pCEC模式更為匹配。但是，這種技術(shù)也存在一些制約其進(jìn)一步發(fā)展的不足：（1）pCEC無冷凝系統(tǒng)，無法解決焦耳熱問題，進(jìn)而無法施加較高電壓，電色譜優(yōu)勢(shì)無法完全得以體現(xiàn)，待分析物質(zhì)主要是依靠色譜機(jī)理分離，使得其應(yīng)用范圍具有一定局限性；（2）毛細(xì)

13、管填充柱的制備對(duì)裝填技術(shù)要求較高，且由于毛細(xì)管柱兩端需要燒制柱塞，使得填充柱易產(chǎn)生氣泡，影響分離分析。毛細(xì)管整體柱采用原位聚合法，制備過程簡(jiǎn)單方便，通透性好，同時(shí)避免了在柱兩端燒制柱塞的問題。所以尋找適宜整體柱的電色譜模式可以很大程度上拓展其應(yīng)用范圍。
　　 3.商品化的電泳儀既配有冷凝系統(tǒng)，又可以在柱兩端施加較高的直流電壓，使得運(yùn)用整體柱進(jìn)行分離時(shí)在施加高電壓時(shí)不致產(chǎn)生過大的焦耳熱，且在電泳儀上進(jìn)行電色譜實(shí)驗(yàn)時(shí)，平塞流型的EO

14、F作為主要驅(qū)動(dòng)力，使色譜峰型更為尖銳，柱效更高。因此本章首先對(duì)甲基丙烯酸酯類整體柱的單體混合物比例以及三元致孔劑的比例進(jìn)行進(jìn)行了單因素考察和優(yōu)化；其次，在結(jié)合快速分離和柱效優(yōu)化的基礎(chǔ)上選取最為合適的整體柱建立快速分離、分析蛇床子提取物中主要活性成分異虎耳草素、香柑內(nèi)酯、歐前胡素以及蛇床子素的CEC方法，并將其與HPLC，pCEC進(jìn)行比較，結(jié)果證明運(yùn)用有機(jī)聚合物整體柱的CEC方法，在保證所有物質(zhì)基線分離的基礎(chǔ)上，分析時(shí)間明顯縮短且柱效更高

15、。
　　 4.本章在上一章的研究基礎(chǔ)上，又對(duì)白芷提取物中的主要活性成分歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯、發(fā)卡二醇以及異歐前胡素進(jìn)行分離分析和含量測(cè)定，并采用目前廣泛使用、技術(shù)較為成熟的甲基丙烯酸丁酯整體柱制備技術(shù)，在流動(dòng)相中添加去氧膽酸鈉作為“動(dòng)態(tài)固定相”，增加分離選擇性，成功解決了該柱因功能性基團(tuán)碳鏈較短（C4）而造成的固定相選擇性不高，溶質(zhì)保留不夠的缺點(diǎn)，成功對(duì)白芷中五種較難單純使用甲基丙烯酸丁酯整體柱分離的香豆素成分進(jìn)行快速有效地分離

16、分析。
　　 5.鑒于毛細(xì)管整體柱的CEC方法具有快速有效的特點(diǎn)，拓展其應(yīng)用范圍，對(duì)抗抑郁藥米氮平進(jìn)行了臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。首先考察了不同電滲流產(chǎn)生劑對(duì)電滲流方向、樣品峰型及靈敏度的影響，最終選擇無電滲流的甲基丙烯酸酯整體柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。接下來通過在線場(chǎng)放大樣品富集技術(shù)（field-amplifled sample injection，F(xiàn)ASI）解決毛細(xì)管微分離系統(tǒng)中的濃度檢測(cè)限較低的問題，最終選擇70％7，腈作為樣品溶劑，使樣品和

17、主要代謝產(chǎn)物的定量下限均達(dá)到2ng/mL。最后，采用液液萃取為前處理方法，使用CEC技術(shù)對(duì)人血漿樣品中的米氮平及其主要代謝產(chǎn)物去甲米氮進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)了常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下快速、經(jīng)濟(jì)地分離分析，并成功應(yīng)用于其臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　 盡管目前為止，運(yùn)用毛細(xì)管整體柱的CEC技術(shù)在分離分析方面有其獨(dú)到之處，但是增強(qiáng)其選擇性仍然是不懈追求的方向。本文在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)今后研究工作的思路和方向進(jìn)行了一定的探索和展望。采用中心組合設(shè)計(jì)法對(duì)中