基于酶催化前體藥物療法的葉酸-PGA偶聯(lián)酶的制備與生物學(xué)研究.pdf

1、抗體導(dǎo)向的酶催化前體藥物療法(ADEPT)是提高化學(xué)治療藥物對(duì)腫瘤選擇性的有效途徑。該療法利用抗體與抗原、酶與底物的雙重選擇性提高抗癌藥物的靶向性，在降低毒性的同時(shí)增強(qiáng)抗癌活性，提高治療指數(shù)。但由于抗體-酶偶聯(lián)物的分子量大且易產(chǎn)生免疫原性，使這種應(yīng)用受到限制。 葉酸受體(FR)是一種通過(guò)聚糖磷脂酰肌醇(GPI)錨著在膜上的糖蛋白，在許多惡性腫瘤細(xì)胞高度表達(dá)，尤其是惡性卵巢癌，而在正常組織中的表達(dá)僅限于難于進(jìn)入血液循環(huán)的上皮細(xì)胞頂

2、膜，且FR的腫瘤表達(dá)密度隨著腫瘤惡化程度的增加而增加。將葉酸受體的天然配體，維生素葉酸，與其他分子連接形成的葉酸偶聯(lián)物能有效地，以葉酸特有的FR介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑攝入細(xì)胞，且不會(huì)導(dǎo)致其親和力降低。正是由于其表達(dá)的特異性及其配體獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，葉酸受體已成為腫瘤治療的理想靶標(biāo)。 與抗體相比，葉酸與葉酸受體的親和力(Kd約0.1nM)比單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的受體親和力強(qiáng)100倍以上，且葉酸具有免疫原性低、易于修飾、體積小(Mr=441.4

3、Da)、易穿透腫瘤、化學(xué)和生物穩(wěn)定性高、成本低、易貯存等優(yōu)點(diǎn)。本課題以葉酸替代ADEPT中起導(dǎo)向作用的抗體，將葉酸與前藥專(zhuān)一性活化酶偶聯(lián)，酶被選擇性靶向至FR表達(dá)陽(yáng)性腫瘤，前藥在酶的特異性催化下轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞毒分子。這種聯(lián)合葉酸介導(dǎo)靶向輸送和ADEPT策略的新理念稱(chēng)為葉酸導(dǎo)向的酶催化前體藥物療法(FDEPT)。 本課題重點(diǎn)研究葉酸-青霉素G酰化酶偶聯(lián)物(Folate-PGA)的制備方法，催化活性與生物分布，評(píng)價(jià)葉酸靶向的PGA聯(lián)

4、合前藥對(duì)FR表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的活性，為FDEPT的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為腫瘤靶向治療提供新思路。 一、Folate-PGA偶聯(lián)酶的制備及其性質(zhì)研究 通過(guò)雙功能偶聯(lián)劑EDC將葉酸與青霉素G酰化酶(PGA)偶聯(lián)，產(chǎn)物經(jīng)凝膠柱層析分離純化；按BCA法測(cè)定偶聯(lián)酶PGA的含量，利用葉酸在363nm處的特征吸收測(cè)定葉酸含量，計(jì)算葉酸與PGA的偶聯(lián)比約為4∶1。 按PDAB法測(cè)定偶聯(lián)酶活力，并考察葉酸偶聯(lián)對(duì)

5、PGA酶穩(wěn)定性和催化活力動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果表明偶聯(lián)酶的比活約為29.8U/mg，原酶為35U/mg，偶聯(lián)酶保留了原酶85％以上的活力；原酶和偶聯(lián)酶在5～8的pH范圍內(nèi)均較穩(wěn)定。原酶和偶聯(lián)酶作用的最適pH均為8.0；最適作用溫度為55℃；偶聯(lián)酶與原酶Km和Vmax值分別為4.92μmol/mL，3.28U/mL和4.71μmol/mL，3.37U/mL。 二、葉酸受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞對(duì)Folate-PGA偶聯(lián)酶的特異性結(jié)合、攝取

6、 利用熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡以及放射性核素標(biāo)記的Folate-PGA測(cè)定葉酸受體表達(dá)陽(yáng)性FR(+)HeLa細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞以及葉酸受體表達(dá)陰性FR(-)A549腫瘤細(xì)胞對(duì)Folate-PGA的結(jié)合與攝取，考察葉酸偶聯(lián)的PGA酶對(duì)FR(+)腫瘤細(xì)胞的靶向性。 熒光顯微鏡下觀察到FITC標(biāo)記的Folate-PGA偶聯(lián)酶與HeLa和SKOV3細(xì)胞于37℃培養(yǎng)4h后，細(xì)胞發(fā)出明亮的熒光，游離葉酸能阻斷細(xì)胞對(duì)Folat

7、e-PGA偶聯(lián)酶的特異性攝取；激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)olate-PGA偶聯(lián)酶在HeLa細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞中的攝取逐漸增加，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；Scatchard分析125I-Folate-PGA于4℃的細(xì)胞結(jié)合特性，結(jié)果表明125I-Folate-PGA與HeLa細(xì)胞特異性結(jié)合的親和常數(shù)Ka為0.009L/pmol，平衡解離常數(shù)Kd為0.11nM，Bmax為5.34pM，每個(gè)細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為4.80×103個(gè)

8、。125I-Folate-PGA與SKOV3細(xì)胞特異性結(jié)合的親和常數(shù)Ka為0.004L/pmol，Kd為0.25nM，Bmax為11.35pM，每個(gè)細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為10.19×103個(gè)。 三、Folate-PGA偶聯(lián)酶的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)分布 采用125I標(biāo)記法和TCA沉淀法研究Folate-PGA偶聯(lián)酶在BALB/c小鼠的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)；以人卵巢癌SKOV3裸鼠為模型，進(jìn)行125I-Folate-PGA的體內(nèi)生

9、物分布和SPECT顯像。結(jié)果表明：125I-Folate-PGA在BALB/c小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為符合二房室分布模型，125I-Folate-PGA和125I-PGA的分布相半衰期t1/2α分別為0.076士0.02h和0.068士0.086h，清除相半衰期分別為1.311士0.243h和1.336士0.322h，兩組間t1/2α和t1/2β無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；125I-Folate-PGA與125I-PGA在卵巢癌裸鼠體內(nèi)

10、8h和24h的腫瘤攝取率存在顯著性差異(P＜0.05)，攝取率分別為0.39±0.05，0.26±0.12％ID/g和0.30±0.01，0.12±0.07％ID/g。125I-Folate-PGA的腫瘤與正常組織(如心、腦、胰腺、肌肉)放射性攝取比值大于1；8h的SPECT顯像顯示125I-Folate-PGA在腫瘤部位有明顯的放射性濃聚；而125I-PGA的腫瘤部位放射性與周?chē)＼浌墙M織影相當(dāng)。 四、Folate-PGA聯(lián)

11、合N-苯乙?；⒚顾貙?duì)FR(+)HeLa和SKOV3細(xì)胞的毒性 HPLC法測(cè)定Folate-PGA偶聯(lián)酶體外催化N-苯乙?；⒚顾?DOXP)釋放阿霉素的活性，結(jié)果表明偶聯(lián)酶和原酶對(duì)DOXP的催化活性相似；以FR(+)HeLa和SKOV3細(xì)胞為模型細(xì)胞，運(yùn)用FDEPT法，考察DOXP在Folate-PGA的特異性靶向作用下釋放出活性阿霉素對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明：當(dāng)PGA濃度為0.28μg/mL(0.01036U/mL)，DOXP

12、聯(lián)合Folate-PGA偶聯(lián)酶使FR(+)HeLa和SKOV3細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性顯著增強(qiáng)，IC50分別由2.26μM降到0.72μM(P＜0.001)，2.45μM降到0.75μM(P＜0.001)，且這種特異性增強(qiáng)的細(xì)胞毒性在添加游離葉酸后完全翻轉(zhuǎn)；而對(duì)于FR(-)A549細(xì)胞，DOXP合并Folate-PGA偶聯(lián)酶的IC50(2.34μM)與DOXP合并未偶聯(lián)葉酸的PGA的IC50(2.36μM)以及單獨(dú)DOXP(IC50=2.0

13、4μM)沒(méi)有顯著性差異。 以上結(jié)果表明：①葉酸易與酶偶聯(lián)，且葉酸修飾不會(huì)導(dǎo)致PGA催化活性的降低；②偶聯(lián)比4∶1的Folate-PGA偶聯(lián)酶能較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)葉酸受體表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的靶向輸送；③Folate-PGA偶聯(lián)酶血漿半衰期較短，24h內(nèi)從循環(huán)中清除，并能特異性靶向至葉酸受體陽(yáng)性腫瘤，保證了在給于前藥之前不會(huì)因?yàn)镕olate-PGA的非特異性結(jié)合而導(dǎo)致前藥在非靶部位激活；④Folate-PGA的特異性靶向作用能提高阿霉素對(duì)F