HAX-1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單一核細胞中的表達及其功能研究.pdf

1、一、研究背景和目的 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性、可累及多器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)復雜，嚴重影響患者，尤其是育齡期女性的身體健康。SLE確切病因和發(fā)病機制尚未闡明，其主要的免疫學特征為B淋巴細胞的多克隆活化，自身反應性T細胞過度活化，機體產生大量自身抗體，循環(huán)免疫復合物沉積于組織和器官，導致多器官系統(tǒng)損害。 近年來研究表明，免疫細胞凋亡障礙在SL

2、E的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著極大作用。由于SLE患者體內淋巴細胞存在著凋亡與抗凋亡因素之間的不平衡，同時在縛胞因子網絡的調控下，體內凋亡或凋亡相關性免疫機制失調，最終導致SLE的多種臨床表現(xiàn)。一方面，凋亡誘導基因如Fas/FasL的表達增加或功能異常的sFas表達增加，淋巴細胞凋亡加速，導致核小體及胞質分子等自身抗原積聚，加上感染等因素的促進作用，巨噬細胞及補體功能下降使其清除受限，凋亡細胞作為免疫原打破機體的免疫耐受狀態(tài)，激活自身反應淋巴細

3、胞，產生自身抗體而致病。另一方面，一些細胞凋亡抑制基因的表達異常，如bcl-2在活動期SLE患者淋巴細胞中高表達，導致活動性SLE患者淋巴細胞逃脫細胞凋亡而處于活化增殖狀態(tài)，導致自身反應T細胞及B細胞壽命延長，自身反應T細胞清除延遲，導致自身免疫異常而致SLE發(fā)生。臨床上，利用糖皮質激素通過抑制過度活化的免疫反應、誘導異?；罨牧馨图毎l(fā)生凋亡來治療SLE取得了良好療效，也表明了SLE體內淋巴細胞異常活化狀態(tài)的存在。 然而，目前

4、對于SLE患者淋巴細胞中凋亡紊亂的研究并不能完全闡明SLE的凋亡異常情況，提示可能同時存在其它未知的因素參與淋巴細胞凋亡的調控。因此，進一步對SLE患者淋巴細胞凋亡異常狀態(tài)進行研究，進一步闡明SLE患者淋巴細胞活化的自身調控機制，才可能找出誘導免疫細胞進入正常凋亡狀態(tài)治療SLE的有效途徑，從而可望從根本上探索控制sLE發(fā)生和發(fā)展的全新策略。 在我們前期的研究中，通過LongSAGE及GLGI技術建立了活動期SLE患者治療前后T淋

5、巴細胞的差異表達基因文庫，發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因HAX-1在活動期SLE患者中表達明顯增高。該基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有強大抗凋亡作用的蛋白質，其抗凋亡的作用機制尚不清楚。目前HAX-1在SLE中的作用及其與SLE發(fā)病和病情的關系國內外尚未見相關研究報道。我們推測HAX-1在sLE患者PBMC中高表達可能通過其抗凋亡機制抑制T、B淋巴細胞凋亡，從而使淋巴細胞過度活化，加速SLE的發(fā)生發(fā)展。因此，我們擬首先研究HAX-1基因在SLE淋巴細胞中的表達

6、，并進一步探討其在SLE淋巴細胞活化異常中的作用。該研究對于深入了解細胞凋亡在SLE發(fā)病過程中的詳細作用，對于部分闡明SLE的發(fā)病機制，并采取有效措施矯正SLE患者體內淋巴細胞的異?；罨癄顟B(tài)，以緩解甚至控制SLE的病情可能具有重要意義。 二、方法與結果 1．首先通過半定量RT-PCR及Western blot方法檢測HAX-1在活動期SLE患者PBMC中的表達，并對其進行亞細胞定位分析。結果發(fā)現(xiàn)SLE患者PBMC中HAX

7、-1基因在mRNA及蛋白質水平的表達均明顯高于健康對照組(P<0.01)，且表達水平和SLE疾病活動性呈正相關，Pearson相關系數(shù)分別等于0.572、0.777，P值均小于0.01，有非常顯著的統(tǒng)計學意義。表明HAX-1在SLE患者PBMC中高表達可能通過其抗凋亡作用參與了SLE的疾病發(fā)展過程。 2．為了證實HAX-1基因的抗凋亡作用，我們構建了HAx-1的真核表達載體pEGFP-C3-HAX-1，用脂質體DMRIE-C體外

8、轉染人T淋巴瘤細胞株Jurkat細胞，并以600 rads電子線照射、去血清培養(yǎng)及10μmol/L地塞米松(DEX)作用于Jurkat細胞誘導凋亡。經酶切測序鑒定，表達載體pEGFP-C3-HAX-1構建成功，且轉染后HAX-1能夠正常表達。通過光鏡、透射電鏡以及TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)轉染pEGFP-C3-HAX-1的Jurkat細胞抗凋亡能力明顯高于未轉染組及pEGFP-C3組，差異均具有顯著性意義，P值均小于0.01，表明HAX-1過

9、表達具有明顯的抗凋亡能力。該結果為進一步進行動物體內試驗，研究抗凋亡基因HAX-1對sLE病情的影響奠定了理論基礎。 3．利用腺病毒載體系統(tǒng)，將HAX-1基因融合到腺病毒載體基因組中，再通過脂質體轉染法，將構建好的重組腺病毒質粒pAdEasy-HAX-1轉染AD293細胞，包裝成為具有感染能力的腺病毒AdHAX-1，并對其進行了PCR、腺病毒滴度、感染力和安全性等檢測。結果經酶切和測序鑒定，重組腺病毒中HAX-1表達明顯增高；包

10、裝后的重組腺病毒經氯化銫密度梯度離心法純化后滴度達3.2×10<'9>TCID<,50>/ml，且能促進小鼠混合淋巴細胞反應，并且無野生型病毒的存在。表明重組腺病毒AdHAXC-1構建和包裝成功，具有較強的感染能力及較高的生物學安全性，為MRL/lpr狼瘡鼠體內實驗奠定了基礎。同時，構建了靶向HAX-1基因的shRNA表達載體pGenesil-HAX-1，經酶切及測序分析，并轉染HeLa細胞，證實載體構建成功。通過RT-PCR及West

11、ern blot試驗證實其在HeLa細胞內的能夠有效引發(fā)RNAi效應，下調HAX-1基因的表達，為進一步研究HAX-1對MRL/lpr狼瘡鼠淋巴細胞的作用奠定了基礎。 4．AdHAX-1經腹腔注射MRL/lpr狼瘡鼠后，觀察小鼠白細胞、尿蛋白、自身抗體的產生、IFN-γ，分泌情況以及腎臟組織免疫復合物的沉積和腎小球的病理變化。同時分離MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)并轉染pGenesil-HAX-1，觀察脾臟淋巴細胞的增

12、殖及IFN-γ，的分泌變化。結果表明HAX-1可使MRL/lpr小鼠的尿蛋白以及IgG型dsDNA抗體、ANA、抗組蛋白抗體、CIC明顯升高，且產生IF-γ水平升高，同時腎臟IgG顯著沉積，腎小球病理損害加重，促進了狼瘡鼠的病變過程，與PBS組及AdEGFP組相比較，除CIC及抗組蛋白抗體外，差異均具有顯著性意義(P<0.01或P<0.05)；pGenesil-HAX-1則可使淋巴細胞的增長率明顯降低(P<0.01)，IFN-γ分泌水平

13、明顯下降(P<0.01)。 三、結論 1．HAX-1在活動期SLE患者PBMC中的表達明顯高于正常對照者，表達水平和SLE的病情活動性呈正相關。 2．HAX-1基因在體內外均具有明顯的抗凋亡作用。HAX-1在Jurkat細胞中過表達使其能夠對抗電子線照射、DEX誘導及去血清培養(yǎng)等誘導凋亡的作用；重組AdHAx-1體內轉染MRL/lpr小鼠，可使其脾臟淋巴細胞凋亡減慢，導致SLE病情加重，下調HAX-1表達則有助于