HLA-DRB1基因和慢性HBV感染相關(guān)性的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一個(gè)重要的全球性問題。全球至少有20億人感染過乙型肝炎病毒，約3.5億人成為慢性感染者。每年約32萬人死于HBV相關(guān)的肝病——慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌。流行病學(xué)資料顯示即使是同種族、同性別、年齡相似的個(gè)體，經(jīng)同一方式感染相同的HBV亞型，也會(huì)造成不同的臨床結(jié)果，提示宿主的遺傳因素在HBV感染慢性化中發(fā)揮重要作用。人類白細(xì)胞抗原(HumanLeukocytesAntigen,H

2、LA)在免疫應(yīng)答的遺傳控制、調(diào)節(jié)和免疫細(xì)胞的相互識(shí)別等方面具有重要的作用；樹突狀細(xì)胞(DendriticCell，DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞，可有效地激活抗原特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此從控制和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的基因—HLA入手，研究慢性HBV感染的遺傳易感性；以免疫反應(yīng)的始動(dòng)者抗原提呈細(xì)胞——DC為起點(diǎn)，探討HBV感染與遺傳易感性的相關(guān)機(jī)制，不僅能夠找到HBV感染后個(gè)體間差異性的關(guān)鍵線索，也能為抗病毒治療和疾病的預(yù)防提供

3、新的思路。本研究的主要內(nèi)容有： 1.HLA-DRB1等位基因與慢性HBV感染的相關(guān)性研究目的：研究HLA-DRB1等位基因與慢性HBV感染之間的相關(guān)性。方法：用PCR-SSP方法對(duì)陜西地區(qū)漢族人慢性乙型肝炎患者108例與正常對(duì)照108人以及慢性乙型肝炎表面抗原攜帶者32人，進(jìn)行HLA-DRB1等位基因分型比較，同時(shí)進(jìn)行HLA-DRB1等位基因分型與HBV不同復(fù)制狀態(tài)相關(guān)性分析。結(jié)果：陜西地區(qū)漢族人正常對(duì)照HLA-DRB1等位基因

4、以DRB1*04(16.2％)，DRB1*09(12.5％)，DRB1*12(11.6％),DRB1*15(13.4％)最為常見；病例組HLA-DRB1*03的等位基因頻率(10.6％)明顯高于健康對(duì)照組(3.7％)，(OR=3.10；P＜0.05)；HLA-DRB1*07等位基因頻率病例組(17.6％)明顯高于健康對(duì)照組(9.3％)，(OR=2.09；P＜0.05)；DRB1*07基因位點(diǎn)在HBV高復(fù)制狀態(tài)多見(OR=2.22；P＜0

5、.05)；HLA-DRB1*15對(duì)照組等位基因頻率13.4％，明顯高于病例組6.9％(OR=0.48；P＜0.05)。結(jié)論HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*07可能與陜西地區(qū)漢族人HBV感染后的慢性化相關(guān)聯(lián)，HLA-DRB1*15可能為陜西地區(qū)漢族人乙肝感染的抗性基因。 2.HLA-DRB1*03等位基因與慢性HBV感染的相關(guān)性研究2.1HLA-DRB1*03基因型健康人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

6、 目的：在體外建立穩(wěn)定的從人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC的培養(yǎng)體系，確保獲得具有一定形態(tài)和功能的DC，為進(jìn)一步探討DC在抗病毒免疫方面作用奠定基礎(chǔ)。方法：用貼壁法從HLA-DRB1*03健康人和非HLA-DRB1*03健康人外周血中獲取單核細(xì)胞，用無血清AIM-V培養(yǎng)基在GM-CSF+IL-4組合聯(lián)合誘導(dǎo)，培養(yǎng)7-9天。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子CD1a、CD40、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)，在掃描電鏡和透

7、射電鏡下觀察DC的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：在GM-CSF和IL-4協(xié)同誘導(dǎo)下，隨時(shí)間變化，培養(yǎng)細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，表面可見毛刺狀突起，體積較前增大；掃描電鏡下，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，有大量不規(guī)則突起，層疊狀皺襞明顯可見。透射電鏡下，胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)沿核邊高度凝聚，線粒體豐富。9天后，細(xì)胞高表達(dá)CD40(89.3％)、HLA-DR(91.17％)和CD86(80.61％)，中度表達(dá)CD1a(51.73％)和CD83(63.12％

8、)，DC純度達(dá)到80％以上。結(jié)論：所培養(yǎng)細(xì)胞具有典型的DC的形態(tài)和表型特征；超微結(jié)構(gòu)顯示，細(xì)胞分化良好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。 2.2HLA-DRB1*03基因型健康人樹突狀細(xì)胞負(fù)載HBsAg后表型和功能的研究 目的：觀察HLA-DRB1*03基因型健康人樹突狀細(xì)胞負(fù)載HBsAg后表型和功能的變化，為進(jìn)一步探討HLA與HBV感染慢性化的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：①分組：隨機(jī)選取HLA-DRB1*03基因型(*03)和非H

9、LA-DRB1*03基因型(N*03)健康獻(xiàn)血員各5人，從外周血中用貼壁法獲得單核細(xì)胞，在GM-CSF+IL-4因子組合聯(lián)合誘導(dǎo)下培養(yǎng)7天，獲得DC細(xì)胞(*03-DC)和(N*03-DC)。將*03-DC采用隨機(jī)同期對(duì)照分組方法分為：*03-DC-HBV和*03-DC-K。同樣方法將N*03-DC分為：N*03-DC-HBV和N*03-DC-K。共4個(gè)研究組。在其中兩組*03-DC-HBV和N*03-DC-HBV中分別加入5ug/mlH

10、BsAg后繼續(xù)培養(yǎng)24h。②MTT法檢測(cè)4組DC刺激T細(xì)胞增殖能力；③LI-12ELISA檢測(cè)比較4組DC分泌LI-12情況；④RT-PCR方法檢測(cè)4組DC的LI-12mRNA表達(dá)；⑤流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較4組DC表面分子表達(dá)。結(jié)果：DC刺激T細(xì)胞增殖能力檢測(cè)顯示，抗原作用后*03-DC-HBV組和N*03-DC-HBV組活化T細(xì)胞能力均分別較*03-DC-K和N*03-DC-K明顯增加(兩組均P＜0.05)，即*03-DC-HBV組和N*

11、03-DC-HBV組變化一致，表明*03-DC-HBV組與N*03-DC-HBV組在活化T細(xì)胞功能上不存在差異。DC分泌LI-12ELISA檢測(cè)顯示：抗原作用后*03-DC-HBV組和N*03-DC-HBV組DC分泌IL-12量均分別較*03-DC-K和N*03-DC-K明顯下降(兩組均P＜0.05)，且*03-DC-HBV組和N*03-DC-HBV組變化一致，說明HBsAg可明顯抑制DC分泌IL-12，并與個(gè)體基因型無關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶

12、鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組DC的IL-12mRNA表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)HBsAg可抑制IL-12mRNA表達(dá)，與ELISA結(jié)果一致。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，抗原作用后，*03-DC-HBV組較*03-DC-K組HLA-DR表達(dá)無顯著變化(84.78±7.42％vs80.56±8.42％，P＞0.05)，而在N*03-DC-HBV組較N*03-DC-K組中HLA-DR分子表達(dá)量明顯增加(94.37±8.46vs78.45±8.15％P＜0.05)

13、。說明*03-DC-HBV組和N*03-DC-HBV組DC表面HLA-DR表達(dá)變化不一致，間接說明*03-DC-HBV組DC表面HLA-DR表達(dá)下降。結(jié)論：體外研究顯示，受HBsAg影響*03-DC-HBV的表型發(fā)生變化，*03-DC-HBV組DC表面HLA-DR表達(dá)下降，但*03-DC-HBV刺激T細(xì)胞增殖的能力較N*03-DC-HBV尚未發(fā)生明顯變化；HBsAg可顯著抑制DC分泌LI-12功能，且其抑制作用與HLA-DRB1基因型無

14、關(guān)；本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究HBV感染的遺傳易感性的相關(guān)機(jī)制和有針對(duì)性的提高易感染群的免疫力提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究通過大樣本的人群調(diào)查，表明HLA-DRB1等位基因和與陜西地區(qū)漢族人慢性乙型肝炎的易感性相關(guān)，HLA-DRB1*03和*07等位基因可能為陜西地區(qū)漢族人慢性HBV感染的易感基因。為進(jìn)一步研究HLA-DRB1*03等位基因攜帶者對(duì)HBV感染具有易感性的相關(guān)機(jī)制，我們體外誘導(dǎo)培養(yǎng)HLA-DRB1*03基因型健康人的樹突狀細(xì)胞

15、，成功地獲得了具有典型表型、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的樹突狀細(xì)胞。將培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞與HBsAg共孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，受HBsAg的影響，HLA-DRB1*03基因型DC表面HLA-DR表達(dá)下降，提示DC負(fù)載HBsAg后的表型變化與HLA-DRB1基因型相關(guān)。HLA-DRB1*03基因型DC表面HLA-DR表達(dá)下降，可能為該等位基因攜帶者對(duì)HBV具有易感性的原因之一。 有關(guān)DC與不同HLA基因型的研究，經(jīng)文獻(xiàn)檢索國內(nèi)未見報(bào)道。