2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 Slit/Robo信號通路在卵巢腫瘤組織及卵巢癌細胞系中表達和意義的實驗研究
   研究背景:Slit/Robo家族最早在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)。Slit蛋白是一類分泌性糖蛋白,脊椎動物中包括三個Slit成員(Slit1-3),它通過受體Roundabout(Robo)發(fā)揮其作為神經(jīng)元遷移的排斥性因子和神經(jīng)軸突導向的作用。哺乳動物的Slit蛋白結構由一個N-端信號肽,四個富含亮氨酸的重復序列(LRRs),九個EGF樣重復

2、序列和一個C-端的半胱氨酸結組成,LRRs是Slit與受體Robo結合必需的區(qū)域。Slit在蛋白水解過程中產生N-末端和C-末端兩個片段,只有全長和N-末端Slit能與細胞膜受體Robo結合發(fā)揮作用。Robo屬于免疫球蛋白超家族的跨膜信號分子,在脊椎動物中有四個成員Robo1-4。Robo1,2,3胞外區(qū)是由5個Ig樣功能區(qū)和3個Ⅲ型纖維連接蛋白(Fibronectin)樣結構域組成;Robo4結構與其他成員差異較大,胞外區(qū)只有兩個Ig

3、樣功能區(qū)。
   Slit/Robo在人類多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有表達,關于其作用的報道則是不一致的。有研究表明,Slit/Robo可作為腫瘤抑制因子,例如在肺癌和乳腺癌中可檢測到ROBO1基因純合子缺失;Slit2可抑制乳腺及直腸腫瘤細胞的生長,在乳腺癌、肺癌、直腸癌、及腦癌等多種腫瘤中Slit/Robo啟動子基因甲基化導致其失去活性;與正常組織或低度惡性腫瘤組織相比,Slit/Robo的表達在包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌及前列腺癌等多

4、種腫瘤中均有下降。與之相反的說法是,某些Slit/Robo成員在很多腫瘤中的表達明顯增高。Wang等報道顯示,中和阻斷Robo1可縮小體內惡性黑色素瘤體積并降低腫瘤的微血管密度,表明Slit/Robo可通過促進血管的生成加劇癌癥的發(fā)生及發(fā)展。因此,依據(jù)不同的腫瘤類型,Slit/Robo發(fā)揮促進或者抑制腫瘤發(fā)展的作用。
   Slit/Robo在多種腫瘤中的表達和作用已被探討,且證實SLIT1、SLIT2、SLIT3、ROBO1基

5、因在一系列上皮性惡性腫瘤中均作為候選腫瘤抑制基因。在卵巢惡性腫瘤中,約90%為上皮性卵巢癌,但是Slit/Robo家族在卵巢腫瘤中的表達及功能卻未有報道,鑒于此,首次應用卵巢腫瘤組織芯片對Slit/Robo家族主要成員(Slit2/3及Robo1/4)在正常卵巢組織及不同組織學類型的卵巢腫瘤組織中的表達情況進行檢測,并利用增殖和遷移實驗探討Slit/Robo信號通路是否對卵巢癌細胞OVCAR-3和SKOV-3增殖侵襲能力產生影響。

6、>   研究目的:
   1.檢測Slit/Robo信號通路的主要成員在正常卵巢組織和不同組織學類型的卵巢惡性腫瘤組織及卵巢癌細胞系中的表達;
   2.探討Slit2對卵巢癌細胞OVCAR-3和SKOV-3增殖、遷移能力的影響;
   3.研究Slit2對卵巢癌細胞OVCAR-3和SKOV-3細胞內ERK1/2和AKT1磷酸激酶的影響。
   研究方法:
   1.免疫組織化學方法:檢測在正常

7、卵巢組織和不同組織學類型的卵巢惡性腫瘤中Sti2/3和Robo1/4的表達,分別以山羊和兔IgG代替一抗作為陰性對照;采用半定量法判定結果,使用ImageJ和Meta Morph圖像分析軟件測得圖片OD值;SigmaStat統(tǒng)計軟件分析不同組織學類型腫瘤組織之間數(shù)值的統(tǒng)計學差異;
   2.Western Blot分析法:檢測在人卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞中Slit2/3和Robo1/4蛋白的表達;以GAPDH

8、和β-actin作為內參照物;
   3.24孔-Transwell系統(tǒng):檢測Slit2處理后卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞的侵襲能力;
   4.結晶紫實驗:檢測Slit2處理后卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞的增殖能力;
   5.細胞劃痕試驗:檢測Slit2處理后卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞的增殖遷移能力;
   6.Western Blot分析法:檢測Sl

9、it2處理后卵巢癌細胞內ERK1/2和AKT1的磷酸化水平。
   結果:
   1.Slit2/3和Robo1/4在正常卵巢組織和卵巢腫瘤組織中的表達:8例正常卵巢組織和8例癌旁正常組織合為一組稱正常對照組,共16例,各不同組織學類型的卵巢惡性腫瘤組織稱為研究組,共192例。在對照組中可檢測到Slit2、Slit3和Robo1呈不同程度的陽性表達,主要分布在卵巢基質細胞;在研究組中Slit2/3和Robo1/4可見不同

10、程度的陽性表達;陰性對照組均未見有著色。
   1)Slit2:在正常對照組、高低級別漿液性囊腺癌、卵黃囊瘤、顆粒細胞瘤和無性細胞瘤中可見陽性著色(OD>2000±680),陽性率分別為75%(12/16),69%(79/115),100%(21/21),100%(6/6),75%(3/4)和80%(4/5)。正常對照組中OD=1971±681,在低級別漿液性囊腺癌中OD=6048±2216,卵黃囊瘤OD=4797±1369,統(tǒng)

11、計分析結果顯示OD值增高較正常對照組有統(tǒng)計學意義;
   2)Slit3:無性細胞瘤OD=17562±4463,陽性率為100%(5/5);卵黃囊瘤OD=16627±6986,陽性率為100%(6/6)。正常對照組OD=1248±789,統(tǒng)計分析結果顯示在無性細胞瘤和卵黃囊瘤中OD值增高較對照組相比差異有統(tǒng)計學意義;
   3)Robo1:在對照組和研究組均有較強陽性著色(OD>9640±640),陽性率均為100%。低

12、級別漿液性囊腺癌OD=33025±3513,高級別漿液性囊腺癌OD=23268±1744,粘液性囊腺癌OD=15336±2213,無性細胞瘤OD=32667±9646,卵黃囊瘤OD=40824±4033,與正常對照組OD=9640±640相比,OD值明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義;
   4)Robo4:無性細胞瘤OD=7100±6200,陽性率為80%(4/5);卵黃囊瘤OD=1570±6980,陽性率為100%(6/6)。與正常

13、對照組OD=452±301相比,OD值明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義。
   2.Slit2/3和Robo1/4蛋白在人卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞中的表達:Slit2抗體在~50KDa左右檢測到蛋白條帶,該位置對應于Slit2 C-末端,與陽性對照(human hepatoblastoma cells)一致;Slit3抗體在~45和~65KDa左右檢測到蛋白條帶,對應于Slit3 C-末端,與陽性對照(mouse

14、thyroid extract)結果一致;均未檢測到全長Slit2/3(~200KDa)和N-末端(~140KDa)。Robo1/4抗體分別在~250KDa和~170KDa左右檢測到蛋白條帶,對應于全長Robo1/4。
   3.人重組Slit2蛋白對卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞增殖侵襲能力的影響:5,10,100 ng/ml Slit2蛋白作用4 d后,與對照組(增殖率為100%)相比,OVCAR-3細胞的增殖

15、率分別為111%,113%,113%;SKOV-3細胞增殖率分別為109%,103%,97%;與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。100 ng/ml Slit2蛋白處理OVCAR-3和SKOV-3細胞16h后,SKOV-3細胞遷移數(shù)目為985±77,對照組為1020±84,兩組相比細胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義;OVCAR-3細胞無遷移。
   4.人重組Slit2蛋白對卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞內E

16、RK1/2和AKT1磷酸激酶的影響:Slit2蛋白處理細胞0,10m,30m,1h,3h后,與對照組(設為1)相比,OVCAR-3細胞內ERK1/2磷酸化水平分別為1.0±0.0,2.4±0.9,1.5±0.7,1.3±0.3,1.8±0.7;AKT1磷酸化水平分別為1.0±0.0,3.4±2.1,3.3±1.8,2.7±0.8,2.9±1.3;SKOV-3細胞內ERK1/2磷酸化水平分別為1.0±0.0,1.2±0.3,2.1±0.7

17、,2.2±1.0,1.3±0.4;AKT1磷酸化水平分別為1.0±0.0,1.1±0.4,1.8±0.9,1.0±0.2,1.0±0.3。統(tǒng)計分析結果顯示兩組相比差異無統(tǒng)計學意義。
   結論:
   1.Slit/Robo信號通路中主要成員Slit2/3和Robo1/4在卵巢癌組織中的陽性表達顯著高于正常卵巢組織中的表達水平;
   2.人重組Slit2蛋白對卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞生長增殖

18、、侵襲遷移能力無明顯促進作用;
   3.人重組Slit2蛋白未激活卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞內ERK1/2和AKT1磷酸激酶。
   第二部分芳香烴受體(AhR)在卵巢腫瘤組織中表達及對卵巢癌細胞系增殖遷移能力影響的實驗研究
   研究背景:芳香烴受體(AhR)是一類配體激活轉錄因子,它在細胞外信號激活下,通過DNA結合調控相應的基因表達,可介導多環(huán)芳烴類化合物的毒性反應(包括致癌性),還參與

19、一些重要的生物學過程,如信號轉導、細胞分化、細胞凋亡等。未與配體結合的情況下大部分AhR位于細胞胞漿內,配體結合后,通過芳香烴受體核轉因子(ARNT),AhR被轉運到細胞核。細胞核內的AhR與DNA上的AhR增強子序列反應元件(DRE)結合,可激活包括細胞色素酶如CYP1A1,CYP1A2和CYP1B1等下游基因的表達。CYP1A1,CYP1A2和CYP1B1是三種被廣泛研究的外源性物質代謝酶,其功能主要是降解外源性有毒物質。同時AhR

20、還會激活p53和p21等基因,從而影響細胞周期調控,以及細胞生長。
   已有研究表明2-(1’H-吲哚-3’-羰基)噻唑-4-羧酸甲酯[2-(1’H-indole-3’-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester,ITE]是內源性的AhR配體,最早是從豬的肺組織中提取的。ITE可結合AhR,激活含DRE的DNA序列的報告基因,其生物效價是BNF(人工合成AhR配體)的5倍

21、。此外,在小鼠肝癌細胞中,ITE的活性可達到TCDD的5-6倍。由于ITE是自然代謝產物無毒性作用,并能高效結合AhR,因此可作為一種潛在的抗癌藥物。雖然AhR在人類卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能仍然不清楚,但AhR在人類卵巢癌中有高表達并且其配體TCDD可以刺激卵巢癌細胞系CAOV-3的增殖等現(xiàn)象均表明AhR在卵巢癌進展過程中發(fā)揮一定的作用。因此,本實驗我們對AhR及其配體ITE在卵巢癌發(fā)生發(fā)展機制中的作用進行探討。
   研究目

22、的:
   1.檢測AhR在正常卵巢組織及不同組織學類型的卵巢惡性腫瘤組織中的表達,并探討其臨床意義;
   2.探討ITE對人卵巢癌細胞系OVCAR-3和SKOV-3細胞增殖和遷移能力的影響。
   研究方法:
   1.組織芯片免疫組織化學方法:檢測在正常卵巢組織和不同組織學類型的卵巢惡性腫瘤中AhR的表達。采用半定量法判定結果,使用Image J和Meta Morph圖像分析軟件測得圖片OD值;Si

23、gma Stat統(tǒng)計軟件分析不同組織學腫瘤組織之間數(shù)值的統(tǒng)計學差異;
   2.結晶紫實驗:檢測ITE處理后OVCAR-3和SKOV-3細胞的生長增殖能力;
   3.24孔-transwell系統(tǒng):檢測TTE處理后OVCAR-3和SKOV-3細胞的遷移能力。
   結果:
   1.AhR在正常卵巢組織和卵巢腫瘤組織中的表達:8例正常卵巢組織和8例癌旁正常組織合為一組稱正常對照組,共16例,各不同組織學

24、類型的卵巢惡性腫瘤組織稱為研究組,共192例。正常對照組AhR表達陰性;在192例不同組織學類型的卵巢惡性腫瘤組織中AhR有陽性表達,主要分布在上皮細胞包漿內;陰性對照組均未見有陽性著色。漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、卵黃囊瘤、惡性畸胎瘤中可見較強陽性著色(OD≥5476±1864),陽性率分別為75%(102/136),60%(12/20),83%(5/6),100%(5/5)。在低級別漿液性囊腺癌中OD=17140±1509,高級別漿

25、液性囊腺癌OD=12610±1469,粘液性囊腺癌OD=7416±2214,卵黃囊瘤OD=5880±2183,惡性畸胎瘤OD=5476±1864,OD值較正常對照組(OD=511±103)升高有統(tǒng)計學意義;
   2.ITE對卵巢癌細胞OVCAR-3和SKOV-3細胞的生長抑制作用:0.1nM,1nM,10 nM,100 nM,1uM,5uM ITE處理細胞2天后,OVCAR-3細胞增殖率分別為88%,79%,78%,77%,7

26、7%,89%,與對照組(100%)相比ITE抑制作用不明顯,差異無統(tǒng)計學意義;ITE處理細胞4天后,OVCAR-3細胞增殖率分別為73%,54%,52%,52%,49%,56%;6天后OVCAR-3細胞增殖率分別為60%,38%,31%,33%,33%,39%;與對照組(100%)相比,ITE對細胞生長抑制作用明顯,有統(tǒng)計學意義。0.1nM-5uM ITE處理細胞2天后,SKOV-3細胞增殖率分別為105%,106%,109%,118%

27、,108%,104%;4天后為102%,102%,103%,105%,102%,101%;6天后為100%,100%,99%,98%,100%,101%,與對照組(100%)相比,ITE對SKOV-3細胞抑制作用不明顯,統(tǒng)計分析結果顯示均無統(tǒng)計學意義;
   3.ITE對卵巢癌細胞SKOV-3侵襲遷移能力的影響:1uM ITE處理SKOV-3細胞2,4,6天后,SKOV-3細胞遷移數(shù)目分別為57±2,54±3,50±8,與對照組

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