對蝦細胞基因轉移技術研究以及對蝦早期胚胎microRNAs的挖掘.pdf

1、對蝦病毒病的頻繁爆發(fā)已對世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失，在體外建立永生性對蝦細胞系對于研究對蝦病毒的侵染機制以及制備有效的抗病毒藥物或疫苗具有十分重要的意義。將永生性轉化因子導入對蝦原代培養(yǎng)細胞是建立永生性對蝦細胞系的一種有效手段。但是由于體外培養(yǎng)對蝦細胞不分裂并且難以被轉染等問題，對蝦永生性細胞系一直未獲成功。因此，急需建立和完善適用于對蝦細胞的有效的基因轉移技術。目前，對蝦的遺傳轉化技術已有了初步的嘗試，所用表達載體分為非病毒和

2、病毒兩種。這些方法均存在較大的缺點，主要表現為高致死率和低轉化率。
　　本文擬(1)克隆對蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因（TCTP）的啟動子(Ptctp)和對蝦白斑病毒(WSSV)早期基因ie1的啟動子(Pie1)，并將其分別插入病毒和非病毒表達載體中，構建含有雙啟動子的表達質粒，通過比較它們在哺乳動物細胞、魚類細胞和對蝦原代培養(yǎng)細胞中啟動基因轉錄和表達的活性，從而尋找適用于對蝦細胞的高效啟動子。(2)將SV40增強子序列插入上述表達載體

3、中，研究其在哺乳動物細胞和對蝦原代培養(yǎng)細胞中促進質粒入核的作用，以尋找適用于不分裂的對蝦培養(yǎng)細胞的促進外源基因表達的增強子。(3)為了提高現有逆轉錄病毒基因轉移系統(tǒng)對對蝦細胞的侵染偏好性，本文擬克隆對蝦白斑病毒WSSV的兩種主要囊膜蛋白基因:vp19和vp28，構建真核表達載體，并通過共轉染包裝細胞的方法，將其引入所包裝病毒顆粒的囊膜上，以期提高現有逆轉錄病毒基因轉移系統(tǒng)的嗜對蝦細胞性。(4)由于非編碼microRNAs在控制細胞分裂和

4、細胞周期調控中發(fā)揮重要作用，因此，本文擬通過生物信息學方法，從對蝦早期胚胎轉錄組序列中預測可能的microRNAs及其靶基因，從而對調控對蝦胚胎發(fā)育和細胞周期的相關microRNAs進行挖掘。
　　在對蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因啟動子Ptctp的活性研究方面，我們成功克隆了刀額新對蝦和日本囊對蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因的啟動子序列，分別命名為Pme-tctp和Pmj-tctp，長度為612 bp，并利用軟件TFsearch和Match對其

5、可能的轉錄因子結合位點進行了預測。同時，成功克隆了增強型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的編碼框序列，然后以pMCs-GFP為基本質粒（含啟動子PLTR），利用雙酶切反應將上述2種啟動子分別定向插入該質粒啟動子(5' LTR)之后，綠色熒光蛋白基因(GFP)或eGFP序列之前，或以eGFP基因替換GFP基因，從而構建了以下五種逆轉錄病毒表達載體質粒，分別為:單啟動子質粒pMCs-PLTR-eGFP以及雙啟動子質粒pMCs-PLTR-Pme-

6、tctp-GFP、 pMCs-PLTR-Pmj-tctp-GFP、pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pMCs-PLTR-Pmj-tctp-eGFP。通過脂質體法將上述五種載體質粒轉染哺乳動物細胞Plat-GP后，在熒光顯微鏡下均可檢測到明顯的綠色熒光信號。與雙啟動子質粒相比，單啟動子質粒pMCs-PLTR-eGFP介導的綠色熒光表達效率和強度均最大，這表明在哺乳動物細胞中LTR啟動子對基因的轉錄表達起主要作用，而Pme-t

7、ctp和Pmj-tctp的插入對LTR啟動子啟動下游報告基因的的表達造成了一定的影響。通過脂質體法將上述五種表達質粒轉染刀額新對蝦Oka器官原代培養(yǎng)細胞中，發(fā)現，單啟動子質粒pMCs-PLTR-eGFP轉染細胞中未觀察到綠色熒光蛋白表達，而其他4種雙啟動子質粒均可檢測到綠色熒光，這表明雙啟動子表達載體可在對蝦細胞中有效啟動基因的轉錄和表達。PCR和RT-PCR檢測結果也表明，脂質體法可以把表達質粒導入對蝦細胞中，但單啟動子質粒不能被轉錄

8、表達，雙啟動子質粒則可以被轉錄表達出mRNA，這與熒光顯微鏡下觀察的結果一致。
　　在提高現有逆轉錄病毒基因轉移系統(tǒng)的嗜對蝦細胞性方面，我們成功克隆得到了對蝦WSSV兩種囊膜蛋白VP19和VP28的基因編碼框序列，長度分別為366 bp和615 bp，分別編碼121和204個氨基酸。將其定向插入真核表達載體pcDNA3.1/V5-HisA，成功構建了pcDNA-VP19和pcDNA-VP28兩個重組表達質粒。通過共轉染不同組合的包

9、裝質粒與病毒報告質粒到包裝細胞Plat-GP中:(1)pMCs-PLTR-eGFP和 pCMV-VSV-G;(2) pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pCMV-VSV-G;(3)pMCs-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和pcDNA-VP28;(4)pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和PcDNA-VP28,進行病毒包裝、滴度測定和對蝦原代培養(yǎng)細胞感

10、染，以比較該系統(tǒng)的嗜對蝦細胞性上的變化。結果表明，所包裝病毒的滴度可達到(1.9-2.1)×108 TU/ml。包裝病毒侵染對蝦原代培養(yǎng)細胞48小時后，沒有共轉染對蝦WSSV囊膜蛋白表達質粒pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的包裝病毒顆粒以及單啟動子驅動的表達載體所包裝的病毒顆粒所感染對蝦細胞中均未觀察到綠色熒光表達。只有共轉染組合(4)包裝而形成的病毒顆粒，才能成功介導報告基因在對蝦原代培養(yǎng)細胞中表達，雖然只檢測到較少的陽性克

11、隆，且熒光強度較弱，但這一結果表明，將對蝦WSSV囊膜蛋白VP28和VP19引入逆轉錄病毒基因轉移系統(tǒng)可明顯提高該系統(tǒng)的嗜對蝦細胞性，雖然效率不高。
　　為了探討對蝦WSSV囊膜蛋白VP28和VP19在提高逆轉錄病毒基因轉移系統(tǒng)的嗜對蝦細胞性上的作用機理，本文利用DAS、Topred2、Tmpred以及HMMTOP四種軟件對VP19和VP28蛋白的疏水性進行了分析，發(fā)現VP19中第36-55和第95-114個氨基酸之間，VP28中

12、第7-27個氨基酸之間為可能的跨膜結構域。為驗證包裝細胞內過表達的VP19和VP28蛋白是否能定位于質膜上，本文分別將eGFP和mCherry基因定向插入到去終止密碼子的vp19和vp28基因序列的C-端，構建了兩種融合蛋白表達載體:pcDNA-VP19-ΔTAA/eGFP（綠色熒光標記VP19蛋白）和pcDNA-VP28-ΔTAA/mCherry（紅色熒光標記VP28蛋白）。利用脂質體法將以上兩種融合蛋白表達載體導入Plat-GP細胞

13、中，過表達48小時后，通過激光共聚焦顯微鏡成功觀察到過表達的VP19和VP28蛋白定位于細胞膜上。這表明本文改造過的逆轉錄病毒基因表達系統(tǒng)的嗜對蝦細胞性與對蝦WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有關。
　　在對蝦早期胚胎的microRNAs挖掘方面，本文又以Illumina平臺獲得的對蝦早期胚胎轉錄組序列為參考，利用BlastN與RNAfold分別進行同源比對分析以及二級結構分析，最終獲得了21條保守的miRNAs序列，分別屬

14、于19個miRNAs家族，分別為mja-miR-14、44、242、287、317、927、966、969、1014、1175、2491、2731、2774、2788、3338、3885、4961、6489和6493。為驗證所預測的對蝦miRNAs的真實性，并比較其在不同發(fā)育時期的miRNAs的表達模式，我們進一步通過RT-qPCR技術分析了這些miRNAs在對蝦原腸胚時期和無節(jié)幼體時期的miRNAs表達模式。發(fā)現，只有其中的15條mi

15、RNAs成功擴增得到了陽性條帶;原腸胚時期的miRNAs表達水平與無節(jié)幼體時期呈現出不同的表達模式;其中mja-miR-3885在兩個發(fā)育時期均具有極高的表達量，表明該miRNAs在對蝦胚胎的發(fā)育過程中具有重要的作用。
　　靶基因預測結果表明，以轉錄組中所有unigene作為參考數據庫，通過miRanda算法和一套嚴格標準進行預測和篩選，最終得到了120個靶基因序列。利用GO和KEGG數據庫對所有預測的靶基因進行分析研究，結果表明

16、所有的靶基因在細胞組分上分為11個類別，在分子功能上分為10個類別，在生物學功能上分為18個類別。其中19個靶基因涉及31個代謝通路，主要的代謝途徑有:RNA降解途徑、Wnt信號通路、細胞周期以及礦物質吸收等，這些對胚胎發(fā)育均具有重要作用。在靶基因預測的過程中，11個靶基因被注釋與對蝦胚胎的發(fā)育行為和免疫有關。本文還對其中的七個基因進行了RPKM值統(tǒng)計以及RT-qPCR表達豐度分析。上述miRNAs及其靶基因在不同發(fā)育時期的表達模式結果

17、提示我們，對蝦也具有一個復雜的miRNA: mRNA調控網絡用于精準調控其胚胎發(fā)育過程。
　　總之，本文對對蝦TCTP基因啟動子(Ptctp)和WSSV早期基因ie1啟動子(Pie1)在對蝦原代培養(yǎng)細胞中的活性以及SV40增強子序列在對蝦細胞中的DTSs活性進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現這兩種啟動子均能介導外源基因在對蝦細胞中的表達，雖然表達效率還不高。SV40能夠明顯提高動物細胞中載體的入核效率。本文還在此基礎上建立了一套嗜對蝦細胞的逆轉