R-Ras基因在胰腺癌發(fā)病過程中的作用及其對(duì)信息通路影響的初步探討.pdf

1、目的:胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。因早期無特異表現(xiàn),大多數(shù)的胰腺癌患者在就診時(shí)已有局部的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。盡管現(xiàn)在手術(shù)切除率有很大提高,但預(yù)后仍很差。故當(dāng)務(wù)之急是要深入研究與胰腺癌密切相關(guān)的基因表達(dá)譜的改變,找出與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)特性、治療敏感性及不同預(yù)后有關(guān)基因,以指導(dǎo)其早期診斷、癌癥特征分析和預(yù)后判斷。近年來ras基因突變與胰腺癌的關(guān)系引起較高的關(guān)注。其中K-ras基因與胰腺癌的關(guān)系得到了廣泛研究,而對(duì)于R-ras在胰腺癌

2、中的表達(dá)研究,目前尚未見報(bào)道。本研究旨在了解人胰腺癌組織中R-ras的表達(dá)情況及其與胰腺癌組織分化程度的關(guān)系,并初步探討R-Ras基因在胰腺癌發(fā)病過程中的作用及其機(jī)制。方法:采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)67例人胰腺癌與癌旁組織中R-ras蛋白表達(dá)水平并同P21 ras與PCNA的表達(dá)情況進(jìn)行比較,陽性對(duì)照為已知陽性的胰腺癌切片,空白對(duì)照為已知陽性的胰腺癌切片,不加二抗,以PBS代替。光鏡下觀察以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性,采用雙盲

3、法計(jì)數(shù)1000個(gè)癌細(xì)胞,按陽性細(xì)胞所占百分比確定:陽性細(xì)胞數(shù)<5％為陰性(-),陽性細(xì)胞數(shù)5%~24%為弱陽性(+),陽性細(xì)胞數(shù)25%~50%為中度陽性(++),陽性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽性(+++)。計(jì)算陽性率時(shí)將陽性細(xì)胞數(shù)≥5%統(tǒng)一計(jì)為陽性。所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用卡方檢驗(yàn),組間比較采用秩和檢驗(yàn),等級(jí)分組資料比較采用Ridit法,用Spearman方法進(jìn)行相關(guān)性分析,規(guī)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、意義。設(shè)計(jì)合成引物,高保真PCR法擴(kuò)增R-ras全長(zhǎng)序列,構(gòu)建pcDNA3.1(+)-R-Ras重組質(zhì)粒并擴(kuò)大培養(yǎng);采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至panc-1胰腺癌細(xì)胞,采用MTS法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。并采用Corning公司的Transwell體外侵襲方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染至上述重組質(zhì)粒后panc-1胰腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力改變情況。用western法分析panc-1胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)

5、-R-Ras重組質(zhì)粒后MAPK通路中Erk1/2,p38和JNK/SAPK的改變;并檢測(cè)JNK抑制劑SP600125對(duì)轉(zhuǎn)染后panc-1胰腺癌細(xì)胞體外細(xì)胞增殖影響。結(jié)果:1.R-ras蛋白在原發(fā)性胰腺癌中表達(dá)水平升高免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明R-ras、P21ras及PCNA在原發(fā)性胰腺癌中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織中相應(yīng)陽性表達(dá)率,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按分化程度分組比較R-ras蛋白在胰腺癌中陽性表達(dá)率高于相應(yīng)癌旁組織中陽性表達(dá)率,均P=0

6、.000;胰腺癌組織中R-ras蛋白陽性表達(dá)率在不同分化程度的各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X~2=0.664,P=0.717);胰腺癌組織中R-ras陽性表達(dá)水平在不同分化程度的各組間比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X~2=1.4674,P=0.480,Ridit test)。2.R-Ras促進(jìn)細(xì)胞增殖為探討R-Ras對(duì)細(xì)胞增殖的影響,我們分別將pcDNA3.1(+)-R-Ras和pcDNA3.1(+)空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染經(jīng)同步化的胰腺癌細(xì)胞系,48

7、h后用MTS測(cè)定細(xì)胞增殖情況。結(jié)果表明與空白組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染R-Ras后細(xì)胞增殖加快(P<0.05,ANOVA)。提示R-Ras能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。3.R-Ras通過JNK途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖為分析R-Ras促進(jìn)細(xì)胞的作用機(jī)制,我們進(jìn)一步分析了MAPK通路中Erk1/2,p38和JNK/SAPK的改變,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染R-Ras后主要是激活了JNK的活性,用JNK特異性抑制劑10 nM SP600125抑

8、制JNK的活性后,顯著抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖。4.表達(dá)R-Ras并不提高細(xì)胞的侵襲力為分析胰腺癌細(xì)胞在其JNK途徑被激活后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響。我們用Transwell的方法分別比較分析了轉(zhuǎn)染R-Ras細(xì)胞在體外侵襲能力的改變。結(jié)果示轉(zhuǎn)染R-Ras細(xì)胞無論在有或無血清下,均不明顯改變其體外侵襲能力。(P>0.05,ANOVA)。提示胰腺癌細(xì)胞表達(dá)R-Ras可能不增加其侵襲性。結(jié)論:1.R-ras基因在原發(fā)性胰腺癌中表達(dá)增加,但R-ra