交感-副交感神經(jīng)遞質(zhì)在動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生中的研究.pdf

1、自主神經(jīng)系統(tǒng)(交感/副交感)功能紊亂是AS發(fā)生的重要機(jī)制之一，目前的研究已經(jīng)證實(shí)長(zhǎng)期的神經(jīng)刺激一方面可以直接破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，促進(jìn)外膜成纖維細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞增殖遷移，另一方面還可通過(guò)激活核因子NF-κB促進(jìn)多種細(xì)胞分泌炎癥因子，促進(jìn)氧化應(yīng)激，加速病變的進(jìn)程。 血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)病的始動(dòng)因素，外膜一直被認(rèn)為在AS的發(fā)生中只是一個(gè)旁觀者，近期的研究則發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈外膜參與了AS的發(fā)生發(fā)

2、展，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚，Barker等剝離兔頸動(dòng)脈外膜致內(nèi)膜病變的研究為我們提供了良好的研究思路，即通過(guò)外膜損傷血管與正常血管的對(duì)照研究，了解血管外膜在內(nèi)膜病變形成中的作用。此外，解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大中動(dòng)脈的神經(jīng)支配主要為去甲腎上腺素能與膽堿能纖維，且主要分布于血管的外膜以及中外膜交界處，因此外膜損傷對(duì)于去甲腎上腺素能/膽堿能神經(jīng)纖維必然會(huì)造成一定的刺激，但目前關(guān)于這方面的研究尚無(wú)明確報(bào)道。 前脂肪細(xì)胞是自主神經(jīng)系統(tǒng)作用的另

3、一重要靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，去除小鼠脂肪組織的交感神經(jīng)支配后，前脂肪細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，體外給予培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞去甲腎上腺素刺激也能夠明顯抑制其增殖。前脂肪細(xì)胞是炎癥因子的重要來(lái)源，在AS的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，但自主神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)其炎癥分泌功能的影響目前尚無(wú)研究。 基于以上研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)以下幾點(diǎn)進(jìn)行了探討：建立頸動(dòng)脈外膜損傷的兔模型，確定外膜損傷致內(nèi)膜病變形成的作用；對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)在外膜損傷致內(nèi)膜病變過(guò)程中的水平變化及

4、作用進(jìn)行探討；觀察交感/副交感神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)前脂肪細(xì)胞炎癥分泌作用的影響并進(jìn)行機(jī)制探討。 第一部分血管外膜損傷致內(nèi)膜增生性病變模型的建立 目的： 建立外膜損傷致內(nèi)膜病變的動(dòng)物模型，明確外膜損傷在內(nèi)膜增生性病變形成中的作用，觀察通心絡(luò)對(duì)病變的影響。 方法： 采用膠原酶消化+機(jī)械分離的方法建立單側(cè)頸動(dòng)脈外膜損傷的新西蘭兔模型。分別于損傷后1d、3d、1w、2w、4w、8w取材行石蠟切片和冰凍切片檢查，采用

5、HE、免疫組化、掃描電鏡等方法，觀察血管內(nèi)膜增生情況及其構(gòu)成成分。 結(jié)果： 血管外膜損傷后1周即出現(xiàn)內(nèi)膜增生，2周時(shí)達(dá)到頂峰，此時(shí)模型組及通心絡(luò)外膜損傷組兩組內(nèi)膜病變面積/中膜面積(neointima area/mediaarea×100％，IMR)比值分別為24.98±1.91％vs18.57±1.4％，P＜0.05，與對(duì)照組相比也均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。免疫組化檢測(cè)證實(shí)平滑肌細(xì)胞是病變的主要成分。掃描電鏡

6、顯示在外膜損傷后內(nèi)皮先后出現(xiàn)萎縮、脫落、基底膜暴露、血栓形成。 結(jié)論： 膠原酶消化+機(jī)械分離損傷動(dòng)脈外膜這一方法可有效損傷動(dòng)脈外膜；血管外膜損傷可導(dǎo)致內(nèi)膜病變的形成；通心絡(luò)具有抗AS病變作用。 第二部分血管外膜損傷誘導(dǎo)局部交感/副交感神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化 目的：明確外膜損傷對(duì)于局部動(dòng)脈壁組織中交感/副交感神經(jīng)遞質(zhì)濃度去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、乙酰膽堿(Acetylcholin，Ac

7、h)及核因子NF-κB p65水平的影響，觀察通心絡(luò)干預(yù)的效果。 方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為外膜損傷組(單純外膜損傷)、對(duì)照組(單純假手術(shù))、TXL+外膜損傷組(外膜損傷+通心絡(luò)灌胃)以及TXL組(假手術(shù)+通心絡(luò)灌胃)，于手術(shù)后1w、2w、4w、8w取材，采用高效液相方法監(jiān)測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)NE與Ach的變化，免疫組化檢測(cè)血管壁局部組織中磷酸化p65的表達(dá)，western檢測(cè)組織核蛋白中p65的水平。 結(jié)果：1、外膜損傷組外膜損傷后局

8、部NE含量在術(shù)后1W達(dá)到頂峰，Ach在2w達(dá)到頂峰，分別為1256.4±84.97nmol/g與106.6±13.35nmol/g，同時(shí)期對(duì)照組NE與Ach含量分別為857.73±52.86 nmol/g與122.97±7.79nmol/g，NE含量?jī)山M差異明顯，P＜0.05； 2、TXL+外膜損傷組外膜損傷后局部NE與Ach含量在術(shù)后2W達(dá)到高峰，分別為1065.87±70.93nmol/g與114.87±11.99nmol/

9、g；同時(shí)期通心絡(luò)組兩種物質(zhì)含量分別為573.07±44.91nmol/g與90.4±8.80nmol/g，NE含量?jī)山M差異明顯，P＜0.05； 3、外膜損傷后血管壁中磷酸化p65表達(dá)在術(shù)后2W達(dá)到頂峰，通心絡(luò)能夠減少該蛋白的水平；組織核蛋白中p65的水平變化與磷酸化p65一致，在術(shù)后1W、2W與4W時(shí)TXL+外膜損傷組的水平明顯低于模型組，P＜0.05。 結(jié)論：外膜損傷可導(dǎo)致局部神經(jīng)遞質(zhì)釋放的不平衡，激活NF-κB，使得

10、細(xì)胞核內(nèi)p65的水平增加；通心絡(luò)可以通過(guò)抑制延緩NE的釋放、上調(diào)Ach釋放的幅度，減少局部NE-κBp65的活化，最終抑制病變內(nèi)膜的增生。 第三部分交感/副交感神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)前脂肪細(xì)胞的作用及其拮抗劑干預(yù)效果 目的： 前脂肪細(xì)胞是炎癥因子的重要來(lái)源，觀察交感/副交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素、乙酰膽堿及其受體拮抗劑對(duì)培養(yǎng)的小鼠前脂肪細(xì)胞炎癥分泌功能的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。 方法： 藥物刺激細(xì)胞2h、6h

11、、12h、24h后，采用MTT觀察細(xì)胞的增殖能力，Annexin V檢測(cè)凋亡比率，ELISA監(jiān)測(cè)上清中IL-6、IL-10及NGF的動(dòng)態(tài)變化，western檢測(cè)核蛋白中p65的水平。 結(jié)果： 1、NE刺激培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞12h后可以明顯抑制其增殖，Ach則可以在刺激12h后促進(jìn)其增殖，分別為對(duì)照的74.9±3.64％與112±11.4％，P＜0.05，兩種遞質(zhì)的受體拮抗劑都能夠阻斷它們對(duì)細(xì)胞增殖的作用； 2、刺激

12、12h后NE促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，明顯多于對(duì)照組，凋亡比率分別為17.82±0.78％vs3.24±0.19％，P＜0.05。Ach不同的濃度對(duì)于細(xì)胞的凋亡存在雙向作用，0.1uM刺激細(xì)胞12h后細(xì)胞的凋亡比率為12.05±1.05％vs control，P＜0.05；Met和MLA阻斷后都可以明顯減少細(xì)胞的凋亡，兩組凋亡比率分別為10.68±0.79％與8.13±0.95％； 3、NE刺激前脂肪細(xì)胞分泌IL-6，在12h時(shí)達(dá)到高峰，

13、水平明顯高于對(duì)照組，分別為86.08±6.31pg/ml vs46.71±3.02 pg/ml，P＜0.05，其作用可以完全被Met拮抗，拮抗后12h水平為36.91±6.22 pg/ml vs control，P＞0.05；Ach刺激6h后達(dá)到高峰，也明顯高于對(duì)照組，為78.99±4.7 pg/ml vs control，P＜0.05，其效應(yīng)可以部分被MLA阻斷，6h為67.12±4.72pg/ml vs control，P＞0.05

14、；NE抑制細(xì)胞分泌IL-10，在刺激6h后明顯低于對(duì)照組，分別為61.63±1.56 pg/ml vs90.97±4.04 pg/ml，并持續(xù)至24h，為50.81±6.19 pg/ml；Ach刺激12h后明顯降低，也持續(xù)至24h，分別為58.51±7.17 pg/ml與51.35±1.83 pg/ml，美托洛爾可以拮抗NE對(duì)IL-10分泌的大部分作用，而MLA對(duì)Ach則無(wú)明顯阻斷作用；NE刺激前脂肪細(xì)胞分泌NGF作用不明顯，僅在6h時(shí)

15、輕度高于對(duì)照組，分別為96.41±21.53 pg/ml vs83.96±2.81 pg/ml，P＞0.05。美托洛爾阻斷6h后細(xì)胞分泌明顯升高，為126.65±10.36 pg/ml vs control，P＜0.05； 4、NE上調(diào)前脂肪細(xì)胞核蛋白p65的水平，并呈時(shí)間依賴(lài)性；Ach刺激p65蛋白表達(dá)在6h達(dá)到頂峰，此后逐漸下降，但24h時(shí)仍明顯高于對(duì)照水平，兩種遞質(zhì)的受體拮抗劑僅能夠部分阻斷它們對(duì)p65表達(dá)的影響。