氧化應(yīng)激對動物消化道結(jié)構(gòu)與功能影響的研究.pdf

1、氧化應(yīng)激是人類和動物范圍極廣的綜合病癥的主要原因之一。這些綜合病癥包括腸炎、腸蠕動紊亂、各種急性炎癥，諸如創(chuàng)傷愈合過程中出現(xiàn)的炎癥、心血管疾病、神經(jīng)紊亂及一些與代謝有關(guān)的疾病等。其中對消化道的氧化損傷在動物生產(chǎn)中發(fā)生率極高，由于慢性應(yīng)激狀態(tài)下，表征不易察覺，危害性極大。消化道是動物體內(nèi)營養(yǎng)素的消化、吸收和代謝的主要器官，因此，過量的自由基極易誘發(fā)胃腸疾病及消化道功能紊亂。本課題擬建立體外和體內(nèi)氧化應(yīng)激模型，選用大鼠和仔豬為試驗對象，從消

2、化道發(fā)育、結(jié)構(gòu)、功能、功能激素基因表達(dá)等多方面研究自由基對動物胃腸功能的調(diào)控及氧化干預(yù)機制。 1．自由基對離體大鼠小腸上皮細(xì)胞的損傷及干預(yù)研究 選用5只初生未經(jīng)哺乳的Wistar大鼠，于當(dāng)日屠宰取出小腸，并進行小腸上皮細(xì)胞分離。細(xì)胞體外培養(yǎng)72h后，建立黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/XO)體外氧化損傷模型，細(xì)胞隨機分為七組：對照組A加入等量的高溫滅菌的三蒸水，氧化損傷B、C、D各組加入X(10μmol/L)，并分別加入XO(

3、10,40,70 U/L)，抗氧化E、F、G各組加入X(10μmol/L)和谷胱甘肽(GSH，1.5μmol/ml)，并分別加入XO(10,40,70U/L)。應(yīng)激培養(yǎng)24h后，通過測定細(xì)胞活力、DNA片段化、凋亡率及細(xì)胞內(nèi)外氧化還原指標(biāo)，研究氧化應(yīng)激對離體小腸上皮細(xì)胞增值、功能、凋亡的影響以及對細(xì)胞的氧化損傷干預(yù)機制。結(jié)果表明，不同劑量的X/XO均可導(dǎo)致離體大鼠IEC氧化應(yīng)激的發(fā)生。在相對輕度的氧化應(yīng)激條件下(XO，10U/L)，離體

4、大鼠IEC增殖明顯降低，而抗氧化酶合成出現(xiàn)應(yīng)激響應(yīng)，其中SOD的活性略高于對照組(P>0.05)，適度的氧化應(yīng)激可能選擇性的刺激氧化酶的合成。高活性的XO(40、70 U/L)導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化脂質(zhì)化程度顯著提高，細(xì)胞膜通透性增強，細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的明顯增加(P<0.05)；隨著添加的XO活性提高，DNA片段化和細(xì)胞凋亡率均呈上升趨勢。添加GSH提高了離體大鼠IEC抗氧化酶活性及的總抗氧化能力；與相應(yīng)的X/XO單獨處理組比較，GSH

5、顯著降低了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡率；同時GSH顯著降低了XO(10，40 U/L)兩劑量組脂質(zhì)氧化程度(P<0.05)。上述結(jié)果表明：X/XO系統(tǒng)導(dǎo)致離體培養(yǎng)大鼠IEC氧化損傷和細(xì)胞凋亡，輕度的氧化應(yīng)激即可顯著的降低小腸上皮細(xì)胞的增殖，外源性(3St{能夠有效抑制誘發(fā)性氧化應(yīng)激對IEC造成的氧化損傷。 2．半胱胺對吲哚美辛誘發(fā)的胃粘膜氧化損傷及其能量代謝影響 選用45只體重200-250克的雄性SD大鼠。試驗隨機分為

6、3組，對照組(A)：灌服生理鹽水1ml/只；單純應(yīng)激組(B)：灌服吲哚美辛(IND，45mg/kg體重)；抗氧化組(C)：灌服半胱胺(CS，100mg/kg體重)，1小時后灌服IND(45mg/kg體重)。分別在6、12、24小時3個時相點屠宰，分別測定：胃液PH值，血漿生長抑素濃度，胃粘膜潰瘍指數(shù)(UI)，胃壁細(xì)胞H<'+>,K<'+>-ATP酶活性，前列腺素E<,2>(PGE<,2>)，黃嘌呤氧化酶(XO)活性，抗氧化指標(biāo)(SOD，

7、GSH，CAT)，MDA含量，胃粘膜組織中及其線粒體內(nèi)腺苷酸(ATP/ADP/AMP)含量和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的基因表達(dá)。結(jié)果表明：灌服IND的大鼠胃泌酸能力迅速增強，6h即出現(xiàn)胃粘膜損傷，胃粘膜UI隨應(yīng)激時間延長而明顯增加(P<0.05)；CS在試驗后期顯著抑制了胃泌酸，同時降低了UI。IND處理大鼠提高了胃粘膜中H<'+>，K<'+>-ATP和黃嘌呤氧化酶(XO)酶活性，CS有效的抑制了H<'+>，K<'+>-ATP酶

8、和XO活性的提高，但與對照組比較各時相點仍然均有提高。氧化損傷導(dǎo)致血漿中生長抑素的濃度迅速提高，CS使生長抑素在24h降低到生理水平。灌服IND后，各時相點胃粘膜PGE<,2>含量均出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，CS有效的抑制PGE<,2>下降，但仍然低于對照組。IND導(dǎo)致胃粘膜組織的氧化損傷，脂質(zhì)化明顯增強，CS對粘膜起到顯著抗氧化保護作用，降低了脂質(zhì)化程度。氧化應(yīng)激發(fā)生時胃粘膜和胃粘膜線粒體中ATP、ADP、AMP、總腺苷酸池含量及

9、能荷值均有明顯降低，CS處理后使得ADP含量和能荷值與對照組差異不明顯(P>0.05)；其它各項指標(biāo)在線粒體中含量顯著高于損傷組，但在胃粘膜中與損傷組比較差異不顯著。在24h時相點，IND處理組大鼠胃粘膜中iNOS mRNA基因表達(dá)量顯著高于對照組和CS處理組；CS抑制了大鼠iNOS mRNA基因表達(dá)量，但仍然顯著高于對照組(P<0.05)。綜上所述，急性的氧化應(yīng)激導(dǎo)致胃粘膜的氧化損傷，影響了胃正常的分泌功能和結(jié)構(gòu)完整性，組織內(nèi)氧化還原

10、狀態(tài)失衡，粘膜內(nèi)的能量代謝紊亂，能荷降低，促使iNOS mRNA基因表達(dá)增強，抗氧化劑(CS)有效的抑制了氧化應(yīng)激，顯著抑制了部分氧化指標(biāo)的變化。 3．自由基對實驗性腸炎仔豬腸道結(jié)構(gòu)、功能調(diào)控作用研究 選取21±2日齡的斷奶仔豬50頭，利用右旋糖苷硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)仔豬腸炎模型，隨機分為5個處理組，1組，基礎(chǔ)日糧，飲用自來水；2組，基礎(chǔ)日糧，飲用含4％DSS水；3組，基礎(chǔ)日糧+0.03％FeSO<,4>+含4％DSS的

11、水；4組，基礎(chǔ)日糧+0.2％FeSO<,4>+含4％DSS水；5組，基礎(chǔ)日糧+1％FeSO<,4>+含4％DSS的水，試驗期10天。測定仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率、消化率、腸道菌群、腸道通透性、和吸收率、脂質(zhì)氧化程度、腸粘膜自由基和抗氧化指標(biāo)，并進行腸道形態(tài)觀察。結(jié)果表明：在誘導(dǎo)性腸炎仔豬日糧中添加鐵前后，腸道粘膜出現(xiàn)不同程度的氧化應(yīng)激，這和持續(xù)的應(yīng)激減弱了抗氧化防御體系的功能有關(guān)，自由基在炎癥加劇中起到重要作用。低劑量的鐵可以適當(dāng)提高仔豬的

12、生產(chǎn)性能和消化率，但對治療腹瀉效果不顯著(P>0.05)。過量的鐵加重了實驗性腸炎斷奶仔豬腸道粘膜的損傷，加劇了腸炎的癥狀，致使消化率、日增重顯著降低，微生物菌群失衡。高鐵導(dǎo)致的過氧化產(chǎn)物MDA增多，脂質(zhì)氧化降低了仔豬腸道吸收和屏障功能，證明適度劑量的補鐵對缺鐵和患消化道炎癥的仔豬是有利的。 4．高能日糧對仔豬消化器官發(fā)育、功能及氧化還原狀態(tài)的影響試驗 選取21±2日齡的三元斷奶仔豬30頭，隨機分為3組。1組，基礎(chǔ)日糧(

13、含1.5％豆油)；2組，5％豆油日糧；3組，10％豆油日糧。試驗期21天。測定仔豬生產(chǎn)性能，營養(yǎng)消化率，消化器官重量，血清中總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)血漿丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及皮質(zhì)醇濃度，腸粘膜中消化酶活性、IGF-1和GHr基因表達(dá)： 以研究高能日糧誘發(fā)的慢性應(yīng)激對仔豬生長效果及其可能機制。結(jié)果表明：添加5％油脂組顯著提高了仔豬的生產(chǎn)性能，包括ADG、FI，F(xiàn)/G三項指標(biāo)，而添加10％油脂組與對照

14、組比較無明顯差異(P>0.05)。不同劑量油脂添加對小腸重量及脂肪酶的活性均顯著增加(P<0.05)，10％油脂組小腸粘膜重量反而降低；添加油脂對其它器官重及腸道蛋白酶活性無影響；均提高了仔豬血液中的TC、TG濃度，并隨油脂濃度增加呈上升趨勢。而5％油脂組CP、EE消化率均顯著高10％油脂組。10％油脂組誘發(fā)血液中皮質(zhì)醇和MDA顯著提高，抗氧化酶SOD活性明顯下降。5％油脂組小腸粘膜GHR mRNA表達(dá)量略提高，而添加10％油脂卻出現(xiàn)明