人LAK細(xì)胞免疫效應(yīng)分子HMGN2的初步研究.pdf

1、人LAK細(xì)胞(1ymphocyte-activated killer cells，淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)／NK細(xì)胞、CTI細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體抗瘤細(xì)胞系統(tǒng)和抗胞內(nèi)微生物感染的主要免疫細(xì)胞群體。LAK中存在多種具有殺菌作用的活性物質(zhì)，已經(jīng)在LAK細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了穿孔素、顆粒酶、顆粒溶素、LL-37、α-防御素等抗菌分子。LAK細(xì)胞中是否還有其它內(nèi)源性抗菌肽尚不清楚。 將rIL-2、：PHA刺激培養(yǎng)一周的人LAK細(xì)胞用5％的乙酸勻漿，制備

2、酸溶性粗提物。AU-PAGE及電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測(cè)出其中含有三組殺菌多肽成分，分別命名為HLP-1、HLP-2、HLP-3。利用制備性AU-PAGE電泳技術(shù)初步分離獲得這三個(gè)組分。將這三個(gè)組分用反向高效液相色譜技術(shù)進(jìn)一步分離純化，瓊脂糖彌散法篩選純化各組分的抗菌活性，較強(qiáng)抗菌活性的組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳初步測(cè)定分子量及純度。選擇高度純化的蛋白組分HLP-3p21，采取Edman降解法測(cè)定其氮端氨基酸序列，得到H

3、LP-3p21的N-端10個(gè)氨基酸序列，分別為：脯氨酸(Pro，P)，賴氨酸(Lys，K)，精氨酸(Arg，R)，賴氨酸(Lys，K)，丙氨酸(Ala，A)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，天冬氨酸(Asp，D)丙氨酸(Ala，A)，賴氨酸(Lys，K)。將該段氨基酸序列登錄美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館(NCBI)，應(yīng)用。Blast檢索工具進(jìn)行短序列匹配的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)：這段序列與人非組蛋白：HMGN2的氮端氨基酸序列完全相同

4、。對(duì)HLP-3p2l進(jìn)行質(zhì)譜精確分子量分析，其分子量為9274.04 Da，，也與HMGN2相同。使用本實(shí)驗(yàn)室自制的兔抗HMGN2多克隆抗體對(duì)HLP-3p21用做Western blot，結(jié)果顯示HLP-3p2l蛋白條帶處有較強(qiáng)的雜交信號(hào)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，我們判斷HLP-3p21抗菌活性分為HMGN2。 將HMGN2進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性、α-跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的分析，找到其疏水區(qū)及α-跨膜螺旋結(jié)構(gòu)主要位于17-47氨基酸殘基區(qū)域，而這

5、一段結(jié)構(gòu)域同時(shí)也是HMGN2分子的DNA結(jié)合區(qū)，并且在各種物種中具有高度保守性。我們?nèi)斯ず铣蒆MGN2的N端、α-螺旋結(jié)構(gòu)域和C端三個(gè)片段，瓊脂糖彌散殺菌試驗(yàn)顯示HMGN2的α-螺旋結(jié)構(gòu)域具有很強(qiáng)的抗大腸桿菌氨芐青霉素耐藥株ML-35p的活性。而其N端和C端片段沒有抗菌活性。證明了HMGN 2的α-螺旋是其抗菌活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。分別構(gòu)建HMGN2及HMGN2α-跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(下面簡(jiǎn)稱HMGN2 α)的原核表達(dá)質(zhì)粒．pGEX-lλT-HM

6、GN2和pGEX-1λT-HMGN2 α。誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白質(zhì)經(jīng)親和層析純化、凝血酶酶切、AU-PAGE電泳分離得到了純化的HMGN2和HMGN2 α多肽。選用為大腸桿菌氨芐青霉素耐藥株ML-35p、綠膿桿菌ATCC27853、白色念珠球菌ATCC1023和金黃色葡萄球菌ATCC25923四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)HMGN2分子的抗菌譜，MIC和MBC的結(jié)果顯示：HMGN2有抗大腸桿菌ML-35p氨芐青霉素耐藥株、銅綠假單胞菌ATCC27853、白

7、色念珠菌ATCC 10231活性，無抗金黃色葡萄球菌ATCC25923活性。HMGN 2和HMGN2 α的抗菌活性相當(dāng)。 以往的研究顯示HMGN2分子主要定位于細(xì)胞核中，因此確定HMGN2在LAK細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，是確定它是否機(jī)體自身武裝的免疫活性分子的關(guān)鍵。使用本實(shí)驗(yàn)室自制的HMGN2多克隆抗體，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)、ELISA和Western Blot方法對(duì)。HMGN2進(jìn)行定位分析。免疫熒光化學(xué)分析結(jié)果顯示在單個(gè)核白細(xì)胞中僅胞

8、核顯示熒光信號(hào)，而經(jīng)IL-2刺激后的LAK細(xì)胞在胞漿和胞核均出現(xiàn)熒光。這說明經(jīng)IL-2刺激后，部分HMGN2由胞核轉(zhuǎn)移至胞漿。用ELISA方法檢測(cè)LAK細(xì)胞培養(yǎng)上清HMGN2含量，結(jié)果LAK細(xì)胞8天培養(yǎng)上清和2天培養(yǎng)上清中HMGN2的含量比單個(gè)核細(xì)胞中HMGN2的含量明顯升高，用Western-blot檢測(cè)LAK細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HMGN2含量，結(jié)果LAK細(xì)胞8天培養(yǎng)上清濃縮樣品、2天培養(yǎng)上清濃縮樣品和HMGN2蛋白有明顯的雜交信號(hào)，而單