福建香蕉種質(zhì)資源試管保存及野生蕉ISSR與抗寒性分析.pdf

1、香蕉（Musa spp.）是全世界最重要的水果和糧食作物之一，是福建省重要的農(nóng)業(yè)組成部分，福建省具有豐富的栽培香蕉和野生蕉資源，但是福建栽培香蕉受到寒冷、病蟲害等嚴(yán)重威脅，選育抗性香蕉品種是香蕉研究的重點(diǎn)課題，因此，具有優(yōu)良抗性特點(diǎn)的野生蕉是香蕉育種研究的寶貴資源。開展香蕉種質(zhì)資源的收集是利用的前提工作，對(duì)遺傳背景不清晰的野生蕉進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究亦顯得迫切，進(jìn)一步開展香蕉抗寒性研究可為香蕉抗寒育種研究奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要內(nèi)

2、容包括福建香蕉試管苗保存研究、福建野生蕉自然居群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性ISSR分析、三明野生蕉抗寒生理響應(yīng)研究、三明野生蕉抗寒基因脂肪酸去飽和酶家族基因（FADs）克隆和表達(dá)分析，主要研究結(jié)果如下：
　　1.福建香蕉種質(zhì)資源試管保存研究
　　①福建若干香蕉品種（系）花序誘導(dǎo)植株再生
　　以福建野生蕉、粉蕉等6個(gè)香蕉品種（系）的未成熟雄花序?yàn)椴牧?，建立不同品種香蕉花序誘導(dǎo)植株再生體系，并比較其再生特性。結(jié)果顯示，香蕉花序的

3、最佳消毒方式為75％酒精消毒20min，污染率為4.45%；不定芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+NAA0.1mg·L-1+6-BA2.5mg·L-1，誘導(dǎo)率可達(dá)46.67%；以MS+NAA1.0mg·L-1為培養(yǎng)基可獲得生長(zhǎng)健壯的香蕉生根苗，移栽基質(zhì)為泥炭土:田園土:珍珠巖（2:2:1）；栽培香蕉和野生蕉的再生特性具有較大的差異，栽培香蕉不定芽誘導(dǎo)時(shí)間較短，芽體大，試管苗粗壯，根系發(fā)達(dá)，茸毛明顯，野生蕉誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，不定芽易形成多芽體結(jié)構(gòu)，試

4、管苗相對(duì)瘦細(xì)，根系細(xì)長(zhǎng)。
　　②福建香蕉種質(zhì)資源試管苗保存研究
　　香蕉試管苗限制生長(zhǎng)保存研究結(jié)果表明，影響叢生芽高度、叢生芽總數(shù)、叢生芽黃化率和葉綠素含量的因素及其作用大小分別是：甘露醇>6-BA>ABA>NAA、甘露醇>NAA>6-BA>ABA、甘露醇>6-BA>NAA>ABA和6-BA>NAA>甘露醇>ABA。較高濃度的甘露醇和ABA利于香蕉試管苗的保存。試驗(yàn)篩選到最佳保存培養(yǎng)基為MS+0.5mg·g-16-BA+1.

5、0mg·g-1 NAA+1.0mg·g-1 ABA+3.0%甘露醇，pH為5.8，并以篩選的最佳保存方案對(duì)福建若干香蕉資源進(jìn)行了試管保存。試驗(yàn)過(guò)程建立了“GS-YI”評(píng)價(jià)體系（生長(zhǎng)狀態(tài)-黃化指標(biāo)，Growth Status-Yellowing Index）進(jìn)行香蕉離體保存效果的評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括試管苗高度、芽數(shù)、植株形態(tài)、黃化率、黃化等級(jí)和葉綠素含量。
　　2.福建中部3個(gè)野生蕉自然居群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的ISSR分析
　

6、　對(duì)采自福建省三明市和福州市的3個(gè)野生蕉自然居群共100份葉片樣本進(jìn)行ISSR分析，結(jié)果表明：13條引物共擴(kuò)增獲得175個(gè)穩(wěn)定、清晰的條帶，平均擴(kuò)增條帶數(shù)為13.5個(gè)，擴(kuò)增產(chǎn)物主要介于200～2000bp，其中總的多態(tài)性條帶為158個(gè)，居群總多態(tài)性條帶百分率為90.3%；通過(guò)NTSYS和STRUCTUR軟件聚類分析發(fā)現(xiàn)，巖前、莘口和赤壁野生蕉共100份樣本嚴(yán)格按照地理來(lái)源劃分為3個(gè)大組，3個(gè)大組可進(jìn)一步分別劃分為3、3和4個(gè)亞組；采用P

7、OPGENE進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，野生蕉居群總的變異中，群體內(nèi)變異大于群體間變異，野生蕉居群內(nèi)存在豐富的基因交流，3個(gè)野生蕉居群總體多樣性水平較高，從高到低依次為巖前、莘口和赤壁。
　　3.三明野生蕉葉片在低溫脅迫下的生理變化規(guī)律
　　相對(duì)電導(dǎo)率和脯氨酸是2個(gè)衡量植物抗寒的重要生理指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定在低溫脅迫下三明野生蕉葉片相對(duì)電導(dǎo)率和脯氨酸含量，可以初步明確三明野生蕉在低溫下的抗寒生理變化模式。①不同溫度處理下，當(dāng)溫度由

8、28℃降低至0℃的過(guò)程中，相對(duì)電導(dǎo)率總體上呈先升后降再升的趨勢(shì)，而脯氨酸含量隨著溫度的降低呈先降后升再降的變化規(guī)律，兩者呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)溫度為16℃和13℃時(shí)，是電導(dǎo)率和脯氨酸發(fā)生劇烈變化的溫度，說(shuō)明三明野生蕉葉片在16℃時(shí)開始受到低溫影響并啟動(dòng)抗寒響應(yīng)。②隨著低溫（16℃）持續(xù)時(shí)間的增加，三明野生蕉葉片相對(duì)電導(dǎo)率呈“降-升-降-升”的變化模式，而脯氨酸變化模式與相對(duì)電導(dǎo)率變化的模式相反，呈現(xiàn)為“升-降-升-降”。在整個(gè)低溫持續(xù)進(jìn)程中，相對(duì)

9、電導(dǎo)率和脯氨酸均分別于16h和36h時(shí)出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)，此2個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是抗寒響應(yīng)強(qiáng)烈和低溫傷害嚴(yán)重的時(shí)刻，當(dāng)?shù)蜏靥幚頃r(shí)間達(dá)到72h時(shí)，低溫傷害加劇。③三明野生蕉葉片于連續(xù)降溫環(huán)境下進(jìn)行處理，當(dāng)溫度由28℃持續(xù)降溫到一定低溫時(shí)（10℃），相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)下降的同時(shí)，脯氨酸含量亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)香蕉葉片并未受到低溫傷害，導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因可能是：溫度的降低過(guò)程是一個(gè)緩慢的過(guò)程，此時(shí)低于16℃的累積處理時(shí)間僅為9h，三明野生蕉對(duì)緩慢下降的溫

10、度、短時(shí)間的低溫環(huán)境產(chǎn)生了耐受性。隨著溫度繼續(xù)降低，低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，野生蕉受到寒冷傷害并啟動(dòng)抗寒防御，此過(guò)程中三明野生蕉可維持一定的“傷害-抗寒”平衡。
　　4.三明野生蕉FAD家族基因克隆及生物信息學(xué)分析
　?、傩」敖叮∕usa acuminata）全基因組FAD家族基因分析
　　“DH-Pahang”小果野蕉全基因組FAD家族基因檢索結(jié)果獲得17個(gè)FAD基因成員，其中FAD2基因7個(gè)，F(xiàn)AD3和FAD6各1個(gè)，

11、FAD7基因8個(gè)（其中3個(gè)未有完整CDS）。FAD基因CDS的長(zhǎng)度介于1035bp與1344bp之間，F(xiàn)AD2的內(nèi)含子為1～3個(gè)，F(xiàn)AD3和FAD6分別為4和9個(gè)，F(xiàn)AD7的內(nèi)含子為7或8個(gè)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型FADs（FAD2和FAD3）的編碼氨基酸序列長(zhǎng)度總體低于質(zhì)體型FADs（FAD6、FAD7、FAD8）。香蕉全基因組FAD蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示均為 Membrane-FADS-like家族成員，部分FAD蛋白還具有cyt-b5和DUF3

12、474結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明4類FAD蛋白的定位總體上以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體為主。所有蛋白均具有跨膜結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋數(shù)目最少為1個(gè)，最多為5個(gè)，以由內(nèi)而外的跨膜方向居多。二級(jí)結(jié)構(gòu)中以α螺旋和無(wú)規(guī)折卷曲所占比例最高，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角比例較低。卷曲螺旋和信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示FAD蛋白無(wú)螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，也不具信號(hào)肽，不是分泌蛋白。在SWISS-MODEL中預(yù)測(cè)到了3個(gè)FAD2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，分別是MuFAD2、MuFAD2-2a和MuFAD2-2e，而

13、其他FAD成員均未有預(yù)測(cè)模型。
　?、谌饕吧禙AD家族基因克隆及生物信息學(xué)分析
　　試驗(yàn)克隆得到三明野生蕉15個(gè)FAD基因成員（包括可變剪接形式），其中FAD2基因6個(gè)（Mu-FAD2、Mu-FAD2a、Mu-FAD2-2a、Mu-FAD2-2b、Mu-FAD2-2c、Mu-FAD2-2d），F(xiàn)AD3基因2個(gè)（Mu-FAD3-1a、Mu-FAD3-1b），F(xiàn)AD6基因1個(gè)（Mu-FAD6），F(xiàn)AD7基因6個(gè)（Mu-FAD

14、7-2a、Mu-FAD7-2b、Mu-FAD7-3、Mu-FAD7-4、Mu-FAD7-5a、Mu-FAD7-5b）。15個(gè)FAD基因開放閱讀框（ORF）的大小介于1146bp和1844bp之間，可正常編碼的氨基酸殘基數(shù)目介于381和456個(gè)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明三明野生蕉FADs保守結(jié)構(gòu)域均有Delta12-FADS-like結(jié)構(gòu)域和DUF3474特異結(jié)合位點(diǎn)，屬于Membrane-FADS-like超家族。亞細(xì)胞定位以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠

15、體為主。FADs具跨膜結(jié)構(gòu)，磷酸化修飾主要以絲氨酸為主。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明FADs家族成員中，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占有絕大比例，不具卷曲螺旋和信號(hào)肽。預(yù)測(cè)到了2個(gè)FAD2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，分別是MuFAD2-2a，MuFAD2-2e。
　　5.三明野生蕉試管苗FAD家族基因定量表達(dá)分析及FAD7轉(zhuǎn)化煙草研究
　　試驗(yàn)比較了不同溫度、水楊酸及其不同處理時(shí)間下FAD家族成員的相對(duì)表達(dá)量。①水楊酸處理下FADs的表達(dá)量總體低于去

16、離子水處理。由于SA處理維持了香蕉試管苗葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，未通過(guò)誘導(dǎo)FADs高表達(dá)產(chǎn)生抗寒響應(yīng)；反之，當(dāng)以去離子水處理時(shí)，香蕉試管苗仍然遭受低溫傷害，因此FADs受到誘導(dǎo)，大量表達(dá)以防御低溫傷害。同時(shí)，F(xiàn)ADs在各個(gè)處理下的表達(dá)模式呈現(xiàn)多樣化。②8℃低溫不同處理時(shí)間下FAD成員的表達(dá)模式差異較大，短時(shí)間的低溫處理（1h）下，F(xiàn)ADs的表達(dá)均低于未處理，因此突然降溫可抑制FADs的表達(dá)；隨著低溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)ADs表現(xiàn)為長(zhǎng)期低溫

17、誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型2類，前者包括FAD2-1、FAD3和FAD7-2，后者包括FAD2-2、FAD6和FAD7-1。③FADs在不同溫度下的表達(dá)模式可歸納為2類，其一是升高降低型（FAD2-1、FAD2-2、FAD6、FAD7-2）；其二是降低升高型（FAD3和FAD7-1）。在升高降低型的FADs表達(dá)模式中，在20℃處理?xiàng)l件下，F(xiàn)ADs出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄高峰，其他溫度的表達(dá)水平均較低，說(shuō)明野生蕉FAD2-1、FAD2-2、FAD6、FAD7-2在

18、環(huán)境溫度剛開始發(fā)生變化時(shí)即感受低溫并啟動(dòng)抗寒抵御；在降低升高型的FAD表達(dá)模式中，在溫度變化的前期，即在一定低溫以前（8℃以前），隨著溫度的降低FAD3和FAD7-1表達(dá)量隨之降低，表現(xiàn)為惰性反應(yīng)，當(dāng)溫度下降至4℃甚至0℃的過(guò)程中，F(xiàn)AD3和FAD7-1基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量急劇上升，因此2種類型的FADs表達(dá)特點(diǎn)不同，在整個(gè)變溫過(guò)程中協(xié)同互補(bǔ)。
　　將三明野生蕉Mu-FAD7-2a進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究，轉(zhuǎn)化驗(yàn)證結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因