2-氨基壬烷-6-甲氧基四氫萘鹽酸鹽(10b)體外抗真菌活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌感染由于在艾滋病患者，器官移植患者以及其他免疫缺陷患者中具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，已成為一個(gè)嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題。盡管抗真菌藥物品種不斷增加，但仍然滿足不了病情復(fù)雜患者對控制感染越來越高的需求。本課題的研究目的是探討具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗真菌化合物2-氨基壬烷-6-甲氧基四氫萘鹽酸鹽（10b）的體外抗真菌活性和作用機(jī)制，為降低真菌相關(guān)感染提供有用的信息和策略。微量液基稀釋法結(jié)果顯示10b對氟康唑敏感白念珠菌以及氟康唑耐藥白念珠菌均有

2、良好的抗真菌活性，MIC80值的范圍從0.031μg/ml到8μg/ml，活性強(qiáng)與氟康唑或酮康唑相當(dāng)或者更強(qiáng)；對氟康唑耐藥白念珠菌的抗真菌活性強(qiáng)大，其作用普遍強(qiáng)于酮康唑，尤其對氟康唑高度耐藥的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)白念珠菌SC5314R（對氟康唑和伊曲康唑都高度耐藥，MIC80值均為256μg/ml）作用更加顯著，MIC80值為0.125μg/ml。瓊脂平皿紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)10b對氟康唑耐藥白念珠菌的抗真菌活性強(qiáng)于氟康唑和酮康唑并且表現(xiàn)出一定

3、的殺菌作用。生長曲線實(shí)驗(yàn)，半數(shù)抑菌濃度（IC50）測定以及最低殺菌濃度（MFC）測定等多種實(shí)驗(yàn)手段和方法均證實(shí)10b具有強(qiáng)大的體外抗真菌活性。結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)以及XTT還原分析實(shí)驗(yàn)考察了10b對白念珠菌生物被膜的影響，結(jié)果顯示10b對白念珠菌生物被膜的形成以及成熟（48 h）白念珠菌生物被膜細(xì)胞代謝活性均有強(qiáng)大的抑制作用，并且抑制能力強(qiáng)于法尼醇。激光共聚焦顯微鏡觀察也進(jìn)一步證實(shí)了10b強(qiáng)大的抑制白念珠菌生物被膜的作用：正常白念珠菌生物被膜

4、表現(xiàn)為主要由假菌絲和真菌絲組成的典型三維空間結(jié)構(gòu)；當(dāng)白念珠菌細(xì)胞在0 h與10 gM法尼醇共孵育48 h后，被膜的形成沒有受到抑制，仍然主要由真菌絲和假菌絲組成；與0.1μM的10b共孵育48 h后，盡管真菌絲和假菌絲仍然能夠觀察到，但被膜典型的三維空間結(jié)構(gòu)（相互纏繞的絲狀結(jié)構(gòu)和芽生孢子基底層）受到了破壞，被膜主要由酵母態(tài)細(xì)胞組成；當(dāng)lob的濃度增加10倍（1μM），粘附細(xì)胞從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變被徹底抑制，導(dǎo)致了被膜的消失或者僅能生成

5、少量的全部由酵母態(tài)細(xì)胞組成的被膜。為了探討10b對白念珠菌的作用機(jī)制，我們首先采用薄層色譜分析（TLC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）分析考察10b在麥角甾醇生物合成通路上的作用靶點(diǎn)，通過透射電鏡觀察10b處理后對白念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響，然后采用cDNA芯片分析和realtimeRT-PCR分析從分子水平上考察10b處理酵母態(tài)白念珠菌以及被膜態(tài)白念珠菌基因表達(dá)譜的變化，最后采用MTS/PMS還原分析法評價(jià)了10b的體外細(xì)胞毒性。TL

6、C分析結(jié)果顯示10b處理后的薄層色譜圖上羊毛甾醇及其類似物的斑點(diǎn)與酮康唑處理后完全不同，前者斑點(diǎn)直徑明顯變小顏色變淡，甚至觀察不到而后者與空白對照相比斑點(diǎn)直徑顯著增加，顏色變深，這說明10b可能抑制了麥角甾醇生物合成通路上羊毛甾醇C-14去甲基酶之外的其他酶，導(dǎo)致羊毛甾醇向其他中間甾醇的轉(zhuǎn)化。GC/MS分析結(jié)果顯示10b處理組在氣相色譜圖上出現(xiàn)了與酮康唑處理組完全不同的色譜峰，前者所產(chǎn)生的甾醇成分與erg24菌株所產(chǎn)生的甾醇成分完全相同

7、，均以ergosta-8，14-dienol（ignosterol）作為主要甾醇同時(shí)伴隨大量ergosta-8，14，22-trienol的產(chǎn)生而后者則以24-methylene-lanost-8-en-3-ol作為主要甾醇。因此，10b在麥角甾醇生物合成通路上的真正作用靶點(diǎn)可能是ERG24基因編碼的甾醇C-14還原酶而不是ERG11基因編碼的羊毛甾醇C-14去甲基酶。為了證實(shí)上述觀點(diǎn)，我們比較了10b和甾醇C-14還原酶抑制劑丁苯嗎啉

8、（Fm）處理野生型白念珠菌（BWP17）以及erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇成分種類及含量變化情況。雖然10b與嗎啉類都屬于甾醇C-14還原酶抑制劑，但兩者在麥角甾醇生物合成通路上的作用機(jī)制仍然存在差異。嗎啉類除抑制甾醇C-14還原酶外，還抑制由ERG2基因編碼的甾醇C-8異構(gòu)酶，因此丁苯嗎啉處理的野生型白念珠菌（BWP17）除以ergosta-8，14-dienol（ignosterol）作為主要甾醇外，還出現(xiàn)ergosta

9、-8-en-3-ol的堆積。由于甾醇C-8異構(gòu)酶位于甾醇C-14還原酶下游，因此丁苯嗎啉處理的erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇種類及比例均與未處理的erg24菌株完全相同。10b處理的erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇成分與未處理的erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇成分完全相同，但兩者ergosta-8，14，22-trienol與ignosterol的比例卻不同。10b處理組所產(chǎn)生的ergosta-8，14，

10、22-trienol量明顯高于未處理組，這表明10b在麥角甾醇合成通路上除抑制甾醇C-14還原酶活性外，可能還存在另外一個(gè)靶點(diǎn)，并且這個(gè)靶點(diǎn)應(yīng)該位于甾醇C-14還原酶的上游。通過ergosta-8，14，22-trienol與ignosterol比例變化規(guī)律，我們推測它可能是與甾醇C-5去飽和酶相關(guān)的一個(gè)酶。另外，我們發(fā)現(xiàn)ignosterol的量隨著10b劑量的增加而增加，這表明10b在低濃度時(shí)甾醇C-5去飽和酶相關(guān)酶是主要的作用靶點(diǎn)；

11、隨著10b劑量增加，10b與甾醇C-14還原酶的結(jié)和力增強(qiáng)，最終使甾醇C-14還原酶成為占主導(dǎo)作用的靶點(diǎn)。盡管ERG24基因編碼的C-14還原酶是釀酒酵母有氧生長所必須的，但白念珠菌erg24突變體卻能夠在正常有氧條件下在標(biāo)準(zhǔn)限定滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。電鏡觀察結(jié)果也顯示10b處理后細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，光滑，邊界清晰，無胞內(nèi)物質(zhì)外流進(jìn)入胞膜和胞壁之間。這表明10b雖然能夠抑制麥角甾醇生物合成通路上的甾醇C-14還原酶和甾醇C-5去飽和酶相關(guān)酶的活

12、性，導(dǎo)致麥角甾醇含量急劇降低，但由于中間甾醇的替代作用并不能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，也不能完全抑制白念珠菌細(xì)胞的生長。因此，除了抑制麥角甾醇合成通路上的作用靶點(diǎn)之外，10b強(qiáng)大的抗白念珠菌活性必然還存在更為重要的作用機(jī)制。酵母態(tài)白念珠菌芯片分析和Real-timeRT-PCR分析結(jié)果顯示10b處理后，能量代謝相關(guān)基因，包括糖酵解相關(guān)基因（PFK1，CDC19和IHXK2），生醇發(fā)酵相關(guān)基因（PDC11，ALD5和ADH1）以及線粒體呼吸

13、鏈復(fù)合物相關(guān)基因（CBP3，COR1和QCR8）的表達(dá)水平顯著降低。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果顯示10b處理白念珠菌后能夠顯著增加內(nèi)源性活性氧（ROS）的產(chǎn)生，并且能力強(qiáng)于咪康唑。線粒體功能分析結(jié)果表明10b處理后能夠降低線粒體膜電位（△ψm），泛醌-細(xì)胞色素C還原酶（復(fù)合物Ⅲ）活性以及細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。另外，加入抗氧化劑抗壞血酸（ascorbic acid，AA）能顯著降低10b的抗真菌活性。這說明線粒體有氧呼吸鏈的轉(zhuǎn)換與內(nèi)源性ROS產(chǎn)生

14、的增加可能在10b抑制酵母態(tài)白念珠菌活性過程中起了重要作用。被膜態(tài)白念珠菌芯片分析和Real-time RT-PCR分析結(jié)果顯示10b處理后菌絲特異性基因ECE1表達(dá)急劇降低，編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子Nrglp的基因NRG1表達(dá)水平顯著增加，這與10b抑制白念珠菌被膜形成的作用直接相關(guān)。另外，10b處理后還能引起能量代謝相關(guān)基因表達(dá)降低，包括糖酵解相關(guān)基因（HXK2和PFK1），生醇發(fā)酵相關(guān)基因（ADH1）以及內(nèi)源性ROS清除相關(guān)基因（SOD5

15、）表達(dá)水平顯著降低。功能分析結(jié)果顯示加入抗壞血酸能顯著降低10b對成熟白念珠菌生物被膜細(xì)胞代謝活性的抑制效率。上述結(jié)果表明10b對白念珠菌被膜形成的抑制作用可能主要依賴于改變被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，阻斷白念珠菌從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變，最終破壞了白念珠菌生物被膜的形成；線粒體有氧呼吸鏈的轉(zhuǎn)換與內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的增加可能是10b降低成熟白念珠菌生物被膜細(xì)胞代謝活性的重要作用機(jī)制。體外細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果表明：雖然10b劑量依賴性地抑制小鼠胚胎成纖