重組溶葡球菌酶抗菌藥效學及耐藥機制研究.pdf

1、溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一種含Zn2+的內(nèi)(切)肽酶，為單鏈分子，相對分子量約27kDa，最早于六十年代由Schindler和Schuhardt從模仿葡萄球菌(S.simulan)的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)并分離。具有特異性水解細菌胞壁肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)Gly五肽橋聯(lián)(水解第2與第3位Gly形成的肽鍵)的作用。由于Gly五肽橋聯(lián)結(jié)構(gòu)主要存在于葡萄球菌細胞壁，其中又以金黃色葡萄球菌(S.aureus)細胞壁中分布最廣，因而此酶主要對葡萄球菌

2、尤其金葡菌表現(xiàn)很強的溶殺菌作用。此酶抗金葡菌感染的藥用價值在六、七十年代開始得到很多開發(fā)人員的重視，并在大量動物試驗和部分人體治療中得到證明。但此后由于一些抗葡萄球菌效果良好的抗生素如萬古霉素(vancomycin)、替考拉寧(teicoplanin)等相繼出現(xiàn)，加之部分研究者對酶純度和抗原性的顧慮，此酶的藥用研究一度有所延緩。八十年代以后，隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，國內(nèi)外研究人員利用基因重組的方法將此酶成功表達于多種工程菌并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)

3、化，＞90％以上的高純度重組溶葡球菌酶使實現(xiàn)臨床應(yīng)用成為可能。目前隨著耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等耐藥葡萄球菌在醫(yī)院和社區(qū)的日益流行，溶葡球菌酶的藥用價值再次受到人們重視。近十年來重組溶葡球菌酶再次成為抗葡萄球菌新藥開發(fā)的熱點。此外，有研究表明金葡菌對溶葡球菌酶的耐藥機制可揭示金葡菌對另一種重要抗生素——β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性相關(guān)因子的作用，因此本研究從體外、體內(nèi)抗菌活性以及體外誘導(dǎo)金葡菌耐藥機制等方面對此酶進行了研究。

4、一、體外抗菌藥效學研究本研究中，首次大量采用國內(nèi)臨床分離菌，通過測定MIC、MBC、殺菌曲線、聯(lián)合藥敏、抗菌活性影響因素以及掃描電鏡觀察，考查重組溶葡球菌酶的體外抗菌活性。結(jié)果表明，重組溶葡球菌酶抗菌譜單一，僅對葡萄球菌有效，且對金葡菌的抗菌活性優(yōu)于凝固酶陰性葡萄球菌。結(jié)合MBC、殺菌曲線和掃描電鏡結(jié)果，可以判斷此酶為殺菌藥，且作用迅速，呈濃度依賴性殺菌活性。棋盤法聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果顯示此酶與兩種青霉素和奈替米星呈協(xié)同抗菌作用。

5、二、體內(nèi)抗菌藥效學研究通過小鼠腹腔感染保護試驗、兔皮膚開放性創(chuàng)傷感染多次治療試驗、兔皮膚燙傷感染單次治療試驗、小型豬燙傷感染多次治療試驗等考查了重組溶葡球菌酶在動物體內(nèi)及局部病灶的抗金葡菌感染治療作用。結(jié)果表明，對腹腔注射2.3×105CFU/鼠和2.5×105CFU/鼠制成的小鼠腹腔感染模型，重組溶葡球菌酶靜脈給藥的ED50分別為2660U/kg和3070U/kg體重。兔皮膚創(chuàng)傷感染模型中，1U/創(chuàng)面和2U/創(chuàng)面劑量的重組溶葡球菌酶溶

6、液多次給藥治療，與對照組比較，可有效降低創(chuàng)傷感染病灶組織中的金葡菌(包括MSSA和MRSA)，療效與4mg/創(chuàng)面劑量的SD-Ag懸液相當。兔燙傷感染模型中，4個受試劑量組重組溶葡球菌酶單次給藥，與對照組比較，可明顯降低病灶組織中金葡菌計數(shù)。在小型豬燙傷感染模型中，從第4日起，重組溶葡球菌酶高劑量(200U/創(chuàng)面)治療組創(chuàng)面組織中金葡菌計數(shù)即低于對照組和SD-Ag治療組，第8日和第12日，中、低劑量組創(chuàng)面組織中金葡菌計數(shù)也低于對照組和SD

7、-Ag治療組，SD-Ag治療組從第8日至治療結(jié)束，組織中金葡菌計數(shù)也明顯低于對照組。肉眼觀察和組織學觀察中，各治療組創(chuàng)面細菌清除和上皮化情況亦優(yōu)于對照組。表明不同劑量的重組溶葡球菌酶可有效治療不同局部病灶組織中的金葡菌，達到控制感染的預(yù)期效果。 三、體外誘導(dǎo)耐藥機制研究為了解金葡菌對重組溶葡球菌酶可能的耐藥發(fā)生機制，采用重組溶葡球菌酶體外低濃度一步誘導(dǎo)法，對臨床分離金葡菌進行耐藥突變誘導(dǎo)，獲得7株耐酶菌。通過對兩株原代菌和相應(yīng)誘

8、導(dǎo)菌的femA、femB和femX(又稱fmhB)基因進行PCR擴增，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)兩株誘導(dǎo)菌的femA基因存在一定變化，而femB和femX基因均無變化。同時通過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)菌與原代菌相比，對苯唑西林的敏感性明顯提高，尤其MRSA菌，幾乎喪失對苯唑西林的耐藥性。提示其可作為重組溶葡球菌酶與苯唑西林類青霉素聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)。隨后，研究通過將含femA基因的pBBB31穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入一株誘導(dǎo)菌，對誘導(dǎo)菌可能變化的femA進行互補，發(fā)現(xiàn)經(jīng)