微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的研究.pdf

1、香草醛(4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)是最重要的香味物質(zhì)之一，具有香蘭莢豆特有的香氣，廣泛應(yīng)用于食品、糖果、飲料、香料、化妝品及制藥等行業(yè)。隨著人們?cè)絹碓疥P(guān)心健康和營養(yǎng)，崇尚“綠色”、“天然”，美國和歐盟等紛紛對(duì)化學(xué)食品添加劑的使用進(jìn)行了嚴(yán)格的限制規(guī)定，天然香草醛的需求量越來越大。從香莢蘭豆莢中提取的天然香草醛價(jià)格昂貴，產(chǎn)量低，成本高，原料受多方因素限制，不能滿足日益增長(zhǎng)的需求。利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香草醛具有周期短、成本價(jià)格較低、可獲得

2、天然等同產(chǎn)品等優(yōu)點(diǎn)，是最有發(fā)展前途的替代方法之一。 本論文對(duì)微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香草醛進(jìn)行了研究，在從土壤中篩選獲得具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、能高效轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香草醛的菌株Bacillussp.SW-B9的基礎(chǔ)上，對(duì)該菌株進(jìn)行了生理生化特性鑒定以及16SrDNA序列分析，命名為紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)CGMCC1347；繼而對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，首次建立了紡錘芽孢桿菌CGMCC1347轉(zhuǎn)化

3、異丁香酚生成香草醛的樹脂分離耦合體系和異丁香酚—水兩相體系，同時(shí)對(duì)此二體系的底物和產(chǎn)物的分離提取進(jìn)行了研究，成功實(shí)現(xiàn)了兩相體系中固定化細(xì)胞的反復(fù)利用。 對(duì)實(shí)驗(yàn)室所保藏的細(xì)菌、放線菌、真菌進(jìn)行初步篩選發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)7658、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)AS1.7617、黃色短桿菌(Brevibacteriumfiavum)1.7a、黃色短桿菌(Brevibacteriumflav

4、um)AS1.013能產(chǎn)生少量香草醛，最高濃度為0.31g/L；放線菌中諾卡氏菌(Nocardiasp.)33、酒石酸諾卡氏菌(Nocardiatartic)58、諾卡氏菌(Nocardiasp.)56、諾卡氏菌(Nocardiasp.)44和13-1.58能生成香草醛，最高濃度為0.63g/L；真菌中釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)4.1及酵母2.16-7、2.16-8、2.21f、2.21h、SW-57等菌

5、株能生成部分香草醛。 在含有高濃度異丁香酚的篩選平板上獲得的14支菌株均有轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的能力，其中SW-B9的轉(zhuǎn)化能力最好，能從2％異丁香酚生成1.10g/L香草醛，高于文獻(xiàn)報(bào)道的菌種轉(zhuǎn)化水平，并且其進(jìn)一步降解產(chǎn)物香草醛的能力較為微弱。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株和土壤中篩選獲得菌株生成香草醛能力的對(duì)比，最終選用從土壤中篩選獲得的Bacillussp.SW-B9作為進(jìn)一步研究的出發(fā)菌株。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16SrDNA序列分析表

6、明，該菌株為紡錘芽孢桿菌，命名為紡錘芽孢桿菌CGMCC1347，保藏于中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，保存號(hào)CGMCCNo.1347。 紡錘芽孢桿菌CGMCC1347的發(fā)酵條件對(duì)其轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛影響的研究表明，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：玉米漿55，尿素1，K2HPO42，MgSO4·7H2O1，pH7.5，發(fā)酵條件為：37℃，200r/min，裝液量50mL/250-mL三角瓶，發(fā)酵

7、時(shí)間16h。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：玉米漿55，尿素1，K2HPO4·3H2O2，MgSO4·7H2O1，pH7.0，裝液量50mL/250-mL三角瓶，種子培養(yǎng)時(shí)間為12h。進(jìn)一步研究表明，香草醛作為誘導(dǎo)劑能明顯提高菌體細(xì)胞中轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的關(guān)鍵酶系的酶活，其最佳添加時(shí)間為發(fā)酵10h時(shí)，最佳添加量為1mmol/L。 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)香草醛濃度高于1.0g/L時(shí)，存在明顯的產(chǎn)物抑制，通過添加大孔陽離子樹脂HD-8可以有效解

8、除產(chǎn)物抑制，在添加12.5gHD-8，50g/L異丁香酚，0.36g濕細(xì)胞，初始pH7.0，37℃，180r/min下轉(zhuǎn)化72h，香草醛最高濃度可達(dá)8.10g/L。在本樹脂分離耦合體系下，采用正己烷和乙酸乙酯分級(jí)洗脫，香草醛成品晶體得率為45.6％，純度為95.2％，香草醛的總收率為88.7％，底物回收率為82.6％。所用溶劑幾乎可完全回收利用；樹脂HD-8亦可經(jīng)活化重新利用。 通過底物試驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)紡錘芽孢桿菌CGMCC1347

9、對(duì)異丁香酚的耐受性良好，進(jìn)一步建立了異丁香酚-水兩相轉(zhuǎn)化體系，成功解除了產(chǎn)物抑制。通過條件優(yōu)化確定其最佳搖床反應(yīng)條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速180r/min，初始pH4.0，濕細(xì)胞0.48g，異丁香酚60％(v/v)，裝液量20mL，轉(zhuǎn)化時(shí)間72h，香草醛濃度最高達(dá)46.10g/L，為公開文獻(xiàn)最高水平。 對(duì)異丁香酚-水兩相轉(zhuǎn)化體系的分離提取進(jìn)行了研究，選用樹脂吸附法，建立了較完整的分步洗脫體系，實(shí)現(xiàn)底物和產(chǎn)物的有效分離，香草醛的總收

10、率為94.5％，底物回收率為90.4％，回收的底物再利用情況良好；產(chǎn)物的一次結(jié)晶得率為48.4％，香草醛純度為95.6％。 對(duì)反應(yīng)前后細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行的氣質(zhì)聯(lián)用分析表明，反應(yīng)過程中沒有相關(guān)中間產(chǎn)物的生成，由紡錘芽孢桿菌CGMCC1347催化異丁香酚生成香草醛的反應(yīng)為一步轉(zhuǎn)化。 采用海藻酸鈣包埋法對(duì)紡錘芽孢桿菌CGMCC1347細(xì)胞進(jìn)行了固定化研究，確定固定化條件為海藻酸鈉2.5％，細(xì)胞量10％，硬化用Ca2+濃度0.1mo

11、l/L；通過對(duì)固定化細(xì)胞性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其最佳反應(yīng)pH為3.5，最佳反應(yīng)溫度為37℃。游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞在各pH下都較穩(wěn)定；對(duì)于熱穩(wěn)定性，游離細(xì)胞在50℃～60℃范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，而固定化細(xì)胞的耐熱性明顯增強(qiáng)，在50℃～80℃范圍內(nèi)都較為穩(wěn)定；固定化細(xì)胞保藏的酶活半衰期超過25d，游離細(xì)胞的酶活保藏半衰期不足14d。固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性較好，半衰期約為6批次。 在2L攪拌罐式反應(yīng)器(CSTR)中進(jìn)行了紡錘芽孢桿菌CGMCC13

12、47固定化細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化研究，其中最佳轉(zhuǎn)速為200r/min，通氣量為0.8vvm，最高香草醛濃度達(dá)38.07g/L，與搖瓶的水平相當(dāng)；此反應(yīng)器中反復(fù)分批生物轉(zhuǎn)化的固定化細(xì)胞和異丁香酚的回收再利用情況良好，反復(fù)利用6批次時(shí)，香草醛產(chǎn)量較為穩(wěn)定，平均濃度達(dá)39.26g/L。 對(duì)紡錘芽孢桿菌CGMCC1347轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)的香草醛進(jìn)行成本估算，從天然異丁香酚轉(zhuǎn)化為香草醛的原材料成本約為70美元/公斤，成本估算結(jié)果表明本路線制備生產(chǎn)