微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的研究.pdf

1、香草醛(4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)是最重要的香味物質(zhì)之一，具有香蘭莢豆特有的香氣，廣泛應(yīng)用于食品、糖果、飲料、香料、化妝品及制藥等行業(yè)。隨著人們越來越關(guān)心健康和營養(yǎng)，崇尚“綠色”、“天然”，美國和歐盟等紛紛對化學食品添加劑的使用進行了嚴格的限制規(guī)定，天然香草醛的需求量越來越大。從香莢蘭豆莢中提取的天然香草醛價格昂貴，產(chǎn)量低，成本高，原料受多方因素限制，不能滿足日益增長的需求。利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香草醛具有周期短、成本價格較低、可獲得

2、天然等同產(chǎn)品等優(yōu)點，是最有發(fā)展前途的替代方法之一。 本論文對微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香草醛進行了研究，在從土壤中篩選獲得具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)、能高效轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香草醛的菌株Bacillussp.SW-B9的基礎(chǔ)上，對該菌株進行了生理生化特性鑒定以及16SrDNA序列分析，命名為紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)CGMCC1347；繼而對該菌株的發(fā)酵條件進行了研究，首次建立了紡錘芽孢桿菌CGMCC1347轉(zhuǎn)化

3、異丁香酚生成香草醛的樹脂分離耦合體系和異丁香酚—水兩相體系，同時對此二體系的底物和產(chǎn)物的分離提取進行了研究，成功實現(xiàn)了兩相體系中固定化細胞的反復利用。 對實驗室所保藏的細菌、放線菌、真菌進行初步篩選發(fā)現(xiàn)細菌中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)7658、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)AS1.7617、黃色短桿菌(Brevibacteriumfiavum)1.7a、黃色短桿菌(Brevibacteriumflav

4、um)AS1.013能產(chǎn)生少量香草醛，最高濃度為0.31g/L；放線菌中諾卡氏菌(Nocardiasp.)33、酒石酸諾卡氏菌(Nocardiatartic)58、諾卡氏菌(Nocardiasp.)56、諾卡氏菌(Nocardiasp.)44和13-1.58能生成香草醛，最高濃度為0.63g/L；真菌中釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)4.1及酵母2.16-7、2.16-8、2.21f、2.21h、SW-57等菌

5、株能生成部分香草醛。 在含有高濃度異丁香酚的篩選平板上獲得的14支菌株均有轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的能力，其中SW-B9的轉(zhuǎn)化能力最好，能從2％異丁香酚生成1.10g/L香草醛，高于文獻報道的菌種轉(zhuǎn)化水平，并且其進一步降解產(chǎn)物香草醛的能力較為微弱。通過對實驗室保藏菌株和土壤中篩選獲得菌株生成香草醛能力的對比，最終選用從土壤中篩選獲得的Bacillussp.SW-B9作為進一步研究的出發(fā)菌株。生理生化實驗結(jié)合16SrDNA序列分析表

6、明，該菌株為紡錘芽孢桿菌，命名為紡錘芽孢桿菌CGMCC1347，保藏于中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保存號CGMCCNo.1347。 紡錘芽孢桿菌CGMCC1347的發(fā)酵條件對其轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛影響的研究表明，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：玉米漿55，尿素1，K2HPO42，MgSO4·7H2O1，pH7.5，發(fā)酵條件為：37℃，200r/min，裝液量50mL/250-mL三角瓶，發(fā)酵

7、時間16h。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：玉米漿55，尿素1，K2HPO4·3H2O2，MgSO4·7H2O1，pH7.0，裝液量50mL/250-mL三角瓶，種子培養(yǎng)時間為12h。進一步研究表明，香草醛作為誘導劑能明顯提高菌體細胞中轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的關(guān)鍵酶系的酶活，其最佳添加時間為發(fā)酵10h時，最佳添加量為1mmol/L。 研究發(fā)現(xiàn)當香草醛濃度高于1.0g/L時，存在明顯的產(chǎn)物抑制，通過添加大孔陽離子樹脂HD-8可以有效解

8、除產(chǎn)物抑制，在添加12.5gHD-8，50g/L異丁香酚，0.36g濕細胞，初始pH7.0，37℃，180r/min下轉(zhuǎn)化72h，香草醛最高濃度可達8.10g/L。在本樹脂分離耦合體系下，采用正己烷和乙酸乙酯分級洗脫，香草醛成品晶體得率為45.6％，純度為95.2％，香草醛的總收率為88.7％，底物回收率為82.6％。所用溶劑幾乎可完全回收利用；樹脂HD-8亦可經(jīng)活化重新利用。 通過底物試驗考察發(fā)現(xiàn)紡錘芽孢桿菌CGMCC1347

9、對異丁香酚的耐受性良好，進一步建立了異丁香酚-水兩相轉(zhuǎn)化體系，成功解除了產(chǎn)物抑制。通過條件優(yōu)化確定其最佳搖床反應(yīng)條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速180r/min，初始pH4.0，濕細胞0.48g，異丁香酚60％(v/v)，裝液量20mL，轉(zhuǎn)化時間72h，香草醛濃度最高達46.10g/L，為公開文獻最高水平。 對異丁香酚-水兩相轉(zhuǎn)化體系的分離提取進行了研究，選用樹脂吸附法，建立了較完整的分步洗脫體系，實現(xiàn)底物和產(chǎn)物的有效分離，香草醛的總收

10、率為94.5％，底物回收率為90.4％，回收的底物再利用情況良好；產(chǎn)物的一次結(jié)晶得率為48.4％，香草醛純度為95.6％。 對反應(yīng)前后細胞內(nèi)物質(zhì)進行的氣質(zhì)聯(lián)用分析表明，反應(yīng)過程中沒有相關(guān)中間產(chǎn)物的生成，由紡錘芽孢桿菌CGMCC1347催化異丁香酚生成香草醛的反應(yīng)為一步轉(zhuǎn)化。 采用海藻酸鈣包埋法對紡錘芽孢桿菌CGMCC1347細胞進行了固定化研究，確定固定化條件為海藻酸鈉2.5％，細胞量10％，硬化用Ca2+濃度0.1mo

11、l/L；通過對固定化細胞性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其最佳反應(yīng)pH為3.5，最佳反應(yīng)溫度為37℃。游離細胞和固定化細胞在各pH下都較穩(wěn)定；對于熱穩(wěn)定性，游離細胞在50℃～60℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，而固定化細胞的耐熱性明顯增強，在50℃～80℃范圍內(nèi)都較為穩(wěn)定；固定化細胞保藏的酶活半衰期超過25d，游離細胞的酶活保藏半衰期不足14d。固定化細胞的操作穩(wěn)定性較好，半衰期約為6批次。 在2L攪拌罐式反應(yīng)器(CSTR)中進行了紡錘芽孢桿菌CGMCC13

12、47固定化細胞的生物轉(zhuǎn)化研究，其中最佳轉(zhuǎn)速為200r/min，通氣量為0.8vvm，最高香草醛濃度達38.07g/L，與搖瓶的水平相當；此反應(yīng)器中反復分批生物轉(zhuǎn)化的固定化細胞和異丁香酚的回收再利用情況良好，反復利用6批次時，香草醛產(chǎn)量較為穩(wěn)定，平均濃度達39.26g/L。 對紡錘芽孢桿菌CGMCC1347轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)的香草醛進行成本估算，從天然異丁香酚轉(zhuǎn)化為香草醛的原材料成本約為70美元/公斤，成本估算結(jié)果表明本路線制備生產(chǎn)